基于单宁酸/锰网络稳定的角鲨烯-Mn2+纳米乳剂增强亚单位疫苗免疫原性的研究及其应用

本文开发了一种新型纳米乳剂佐剂系统Sq@TA/Mn，通过单宁酸/锰（TA/Mn2+）配位网络稳定角鲨烯（Sq）与锰离子（Mn2+）的共递送，有效解决了亚单位疫苗难以激发强烈CD8+ T细胞应答的难题。研究证实该系统可显著增强抗原提呈细胞（APC）的活性氧（ROS）生成与抗原摄取，并诱导协同的Th1/Th2免疫反应，在细菌性肺炎模型中展现卓越的保护效力，为新型疫苗设计提供了创新策略。

　　

引言

当前亚单位疫苗虽能诱导抗体产生，却常难以激发有效的CD8⁺ T细胞免疫应答。锰离子（Mn²⁺）可通过激活STING通路增强免疫反应，但其临床应用受限于药代动力学问题与潜在神经毒性。角鲨烯（Sq）作为经FDA批准的佐剂成分，可提升树突状细胞内活性氧（ROS）水平，促进抗原内化与抗原提呈细胞（APC）活化。然而，将Mn²⁺、Sq与抗原共同递送至APCs存在技术挑战。本研究利用单宁酸（TA）与Mn²⁺形成金属-酚网络（MPNs），构建了一种新型纳米乳剂佐剂系统Sq@TA/Mn，实现了抗原与双佐剂的协同递送。

材料与方法

通过超声乳化法制备Sq@TA/Mn纳米乳剂，并吸附卵清蛋白（OVA）或重组肽聚糖相关脂蛋白（rPal）形成疫苗。利用动态光散射（DLS）、透射电镜（TEM）和低温透射电镜（Cryo-TEM）表征其理化性质。通过荧光显微镜和流式细胞术评估DC2.4细胞的ROS生成、抗原摄取及溶酶体共定位。体内实验采用C57BL/6小鼠模型，通过肌肉注射疫苗并分析抗原滞留、抗体滴度、T细胞应答及抗感染能力。

结果

纳米乳剂的构建与表征

TA/Mn网络在pH 7条件下形成稳定配合物，其紫外吸收随pH降低而减弱，表明配位作用具有pH依赖性。Sq@TA/Mn纳米乳剂在250 W超声功率下制备，粒径为305.67 nm，分布均匀（PDI=0.24），吸附OVA后粒径为308.3 nm，电位为-43.96 mV。荧光共定位显示OVA成功吸附于乳滴表面（Pearson系数=0.794）。该纳米乳剂在含血清培养基中保持良好稳定性，抗原吸附效率达85.02%。

细胞水平免疫激活

Sq@TA/Mn@OVA在DC2.4细胞中展示出良好的生物相容性（6 h内无显著毒性），并显著提升ROS生成（为TA/Mn@OVA组的1.65倍）。同时，该制剂促进抗原内化（较游离OVA提高3.14倍）并诱导溶酶体肿胀，暗示可能增强抗原交叉提呈。流式细胞术证实其抗原摄取效率显著高于游离OVA与TA/Mn@OVA。

体内安全性与抗原滞留

小鼠接种Sq@TA/Mn@OVA后未出现体重下降或器官病理损伤，血清生化指标（ALT、AST、LDH、BUN等）均正常，证明其系统安全性。体内荧光成像显示抗原在注射部位滞留超过6天，显著长于游离OVA（72 h内清除）和TA/Mn@OVA（192 h），表明其具有显著的抗原储库效应。

体液与细胞免疫应答

Sq@TA/Mn@OVA诱导的OVA特异性IgG滴度较TA/Mn@OVA提高6.54倍，且IgG1与IgG2a均显著上升，提示Th1/Th2平衡应答。该疫苗还促进脾脏效应记忆T细胞（Tem）扩增（CD4⁺ Tem占25.8%，CD8⁺ Tem占20.88%），并显著增加肺组织定居记忆T细胞（TRM）比例（CD8⁺ CD44⁺CD69⁺达63.25%），为呼吸道感染提供长效保护。

抗感染应用验证

以rPal为抗原的Sq@TA/Mn@rPal疫苗在小鼠肺炎模型中引发强效免疫保护。其rPal特异性IgG、IgG1及IgG2a滴度均显著高于Alum@rPal组，且生存率提升至80%（Alum@rPal仅20%），证实该平台对革兰阴性菌感染的卓越防护效能。

讨论

Sq@TA/Mn纳米乳剂通过TA/Mn²⁺网络实现抗原与佐剂的协同递送，其pH响应性降解特性可能促进溶酶体逃逸与抗原提呈。Sq与Mn²⁺在特定浓度下协同诱导ROS生成，激活APC并增强免疫应答。该系统兼具安全性、高效性与通用性，为亚单位疫苗设计提供了新思路。

结论

本研究成功开发了一种基于TA/Mn网络稳定的角鲨烯-Mn²⁺纳米乳剂佐剂系统，可显著增强亚单位疫苗的体液与细胞免疫应答，并在细菌性肺炎模型中证实其防护效力。该平台为感染性疾病的疫苗研发提供了创新技术支撑。