靶向FAP的CAR-NK细胞疗法：宫颈癌及癌相关成纤维细胞的新型精准免疫治疗策略

本综述系统阐述了靶向成纤维细胞活化蛋白（FAP）的CAR-NK细胞在宫颈癌治疗中的突破性进展。研究通过构建第三代（CD28/4-1BB/CD3ζ）抗FAP CAR，证实其在2D/3D模型中特异性清除FAP+肿瘤细胞和癌相关成纤维细胞（CAFs），为克服肿瘤微环境（TME）免疫抑制提供了新策略，兼具治疗特异性与安全性优势。

　　

引言

宫颈癌是全球女性第四大常见癌症，2022年新增病例约66.1万例，死亡34.8万例，晚期患者五年生存率低于20%，亟需新型治疗策略。肿瘤微环境（TME）中的免疫抑制成分（如CAFs）通过分泌TGF-β、IL-10等因子阻碍免疫细胞浸润，是治疗的主要挑战。嵌合抗原受体（CAR）免疫疗法通过定向改造免疫细胞靶向特定抗原，在血液肿瘤中已取得显著成效，但其在实体瘤中的应用仍受限。自然杀伤（NK）细胞因MHC非依赖性、低细胞因子释放综合征（CRS）风险和“现货型”治疗潜力，成为CAR疗法的理想载体。

成纤维细胞活化蛋白（FAP）在超过90%的上皮癌基质成纤维细胞中高表达，而在正常成纤维细胞和健康组织中表达极低，是理想的治疗靶点。本研究首次探索抗FAP CAR-NK细胞在宫颈癌及CAFs治疗中的 efficacy 与机制。

材料与方法

细胞培养与分离

宫颈癌细胞系（SiHa、HeLa、CaSki）、原代宫颈癌细胞及CAFs采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。NK-92细胞培养中添加400 IU/mL人IL-2，原代脐血NK细胞（pNK）采用NK MACS培养基并添加IL-2（500 IU/mL）、IL-15（70 ng/mL）。原代细胞从手术切除的宫颈癌组织中经胶原酶IV/Dispase II消化分离，依据形态学（梭形/星形为CAFs，上皮样为癌细胞）和增殖特性分类。

载体构建与转导

采用自失活（SIN）甲逆转录病毒载体构建第三代抗FAP CAR，包含ESC11 scFv、FLAG标签、IgG1 CH3铰链区、CD28跨膜域、CD28/4-1BB共刺激域及CD3ζ信号域，并通过IRES-eGFP报告基因标记（ΔCAR对照组缺失胞外域）。病毒颗粒经HEK-293T细胞包装后，通过逆转录蛋白预包被的离心转导法导入NK-92细胞，原代NK细胞采用MOI30连续两天转导并添加Synperonic F-108增强效率。

功能学检测

通过免疫组化、流式细胞术检测FAP表达；细胞毒性通过流式（靶细胞mCherry/红色荧光标记）和活细胞成像（CELLCYTE X^TM/Incucyte? S3）分析；脱颗粒实验检测CD107a表达；细胞因子释放采用LEGENDplex 13-plex panel检测；Western blot验证CAR蛋白表达；载体拷贝数通过qPCR（WPRE/PTPB2引物）定量。

结果

FAP在宫颈癌及CAFs中的高表达

免疫组化显示宫颈癌组织（#1–#3）中FAP⁺细胞占比70.9–85.8%，显著高于健康组织（28.3%）。流式检测证实CaSki细胞FAP阳性率74.1%（gMFI增加2.5倍），而HeLa（8.8%）和SiHa（2.9%）表达低。原代CAFs（CP2、CP3等）FAP阳性率最高达98.8%（gMFI增加3.2–11.5倍），而原代癌细胞（CP5、CP17）无FAP表达。

抗FAP CAR-NK细胞的构建与表征

流式及Western blot证实NK-92细胞中CAR表达率≥90%，CD3ζ条带符合预期分子量（抗FAP CAR约67 kDa，ΔCAR约38 kDa）。载体拷贝数分析显示抗FAP CAR-NK-92和ΔCAR-NK-92细胞的平均拷贝数分别为0.82±0.12和1.03±0.27，提示低插入风险。

二维模型中的特异性杀伤

与未修饰或ΔCAR-NK细胞相比，抗FAP CAR-NK-92细胞在1:1–10:1 E:T比例下对FAP⁺ CaSki细胞和原代CAFs展现显著增强的细胞毒性（48小时近乎完全清除），而对FAP^?原代癌细胞（CP5、CP17）无特异性杀伤。脱颗粒实验显示抗FAP CAR-NK细胞与FAP⁺靶细胞共培养后CD107a表达升高1.5倍。原代CAR-NK细胞（脐血来源）同样高效清除CaSki细胞，且 donor #2细胞伴随IFNγ和Granzyme B释放增加。

三维球体模型中的疗效验证

在混合球体模型（癌核心+CAFs外围）中，抗FAP CAR-NK-92细胞在1:1 E:T比例下72小时内清除90% CAFs（CP2、CP3等），并破坏球体结构，而未修饰NK细胞仅引起核心松散化。抗FAP CAR-NK细胞对CaSki球体的清除效果显著优于对照组，且在高比例（5:1）下作用更迅速。

讨论

TME挑战与CAR设计优化

宫颈癌TME中CAFs通过分泌TGF-β、IL-10等抑制免疫细胞功能，并下调MHC-I表达以逃逸T细胞识别。第三代CAR（CD28/4-1BB/CD3ζ）在增强持久性与细胞因子分泌的同时，因NK细胞本身低CRS风险而更具安全性。甲逆转录载体的中性整合特性进一步降低致瘤风险。

FAP靶点治疗潜力与联合策略

FAP在成人组织中仅限于肿瘤基质和纤维化病变，正常组织几乎不表达，保障了治疗安全性。临床前及早期临床试验（NCT01722149、NCT03932565）均未报告抗FAP CAR-T相关毒性。针对FAP^?癌细胞残留问题，可联合靶向癌胚抗原（如EGFR）的CAR疗法，或采用序贯治疗（先清除CAFs再增强免疫浸润）。

NK细胞来源选择与转化前景

脐血NK细胞虽表型较外周血幼稚，但增殖力强且 donor 间一致性高，配合IL-15表达盒可延长体内持久性。iPSC-NK细胞适合规模化生产，但需优化成熟度 protocol。NK-92细胞作为研究模型具可靠性，但原代NK细胞在部分靶点上展现更强固有毒性，提示需根据靶点特性选择效应细胞来源。

结论

本研究首次证实抗FAP CAR-NK细胞能特异性清除宫颈癌中的FAP⁺癌细胞和CAFs，突破TME免疫抑制屏障，且安全性良好。其疗效在2D/3D模型中均得到验证，为宫颈癌及其他FAP高表达疾病（如纤维化病变）提供了新型免疫治疗策略。