Grin2b突变小鼠通过抑制消退和慢性杏仁核突触/神经元功能障碍表现出增强的远期恐惧记忆

本研究针对自闭症谱系障碍（ASD）患者长期创伤性恐惧记忆的机制难题，利用携带人类ASD风险突变（Grin2bC456Y/+）的小鼠模型，发现其情境恐惧记忆获取正常但消退抑制，并表现出增强的远期恐惧反应。通过化学遗传学激活基底杏仁核（BA）神经元，成功改善恐惧消退缺陷并逆转突触兴奋性传输和神经元兴奋性的抑制，揭示了Grin2b突变导致恐惧记忆异常的新机制，为ASD共病创伤后应激障碍（PTSD）提供了重要理论基础和治疗方向。

　　

自闭症谱系障碍（ASD）是一种复杂的神经发育性疾病，患者除了社交障碍和重复刻板行为这两个核心症状外，还常常伴有多种共病，其中创伤后应激障碍（PTSD）的发生率比普通人群高出约十倍。这种共病不仅加重了ASD的核心症状，还会导致社交焦虑、恐惧、恐惧症和回避等认知行为困难，严重影响着患者的生活质量。然而，尽管对ASD本身机制的研究已取得不少进展，但对其PTSD样表型及相关神经机制的研究却相对匮乏。与此同时，N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）及其GluN2B亚基（由GRIN2B基因编码）在脑发育和功能中扮演着关键角色，其致病性变异与一系列神经发育和精神疾病密切相关，包括ASD。因此，探究特定GRIN2B突变如何影响恐惧相关回路的功能，对于理解ASD共病PTSD的机制具有重要的意义。

为了深入探究这一问题，研究人员将目光投向了一种携带人类ASD患者来源的GluN2B-C456Y点突变的小鼠模型——Grin2b^C456Y/+小鼠。先前的研究表明，这种小鼠存在NMDAR功能失调以及行为和感觉异常，但其在社交、焦虑和恐惧领域的ASD相关大脑功能如何受到影响尚不清楚。本研究旨在系统评估该模型小鼠的恐惧记忆相关行为，并揭示其背后的神经环路和细胞机制。研究成果最终发表在国际知名期刊《SCIENCE ADVANCES》上。

本研究综合运用了行为学分析（包括情境恐惧条件反射、旷场、高架十字迷宫和三室社交测试）、免疫组织化学（c-fos染色以评估神经元活动）、离体脑片电生理记录（测量自发微型/自发兴奋性/抑制性突触后电流mEPSCs/sEPSCs/mIPSCs/sIPSCs、神经元内在兴奋性、NMDA/AMPA受体电流比等）以及化学遗传学技术（使用AAV病毒介导的DREADD系统在CaMKIIα阳性神经元中特异性表达hM3Dq或hM4Di受体，并通过腹腔注射CNO或DMSO进行操控）。所有实验均使用与野生型（WT）同窝对照的Grin2b^C456Y/+小鼠，并在行为学测试中严格遵循盲法原则。

Grin2b^C456Y/+小鼠表现出抑制的恐惧记忆消退和增强的远期恐惧记忆反应

研究人员首先对小鼠进行了情境恐惧条件化测试。结果显示，与WT小鼠相比，Grin2b^C456Y/+小鼠在恐惧记忆的获取（第1天）阶段表现正常。然而，在随后连续5天的恐惧记忆消退训练（第2至第6天）中，突变小鼠的消退过程明显受到抑制，其冻结水平下降幅度小于WT小鼠。更重要的是，在恐惧记忆形成30天后进行远期记忆提取测试时，Grin2b^C456Y/+小鼠表现出显著增强的恐惧反应。这种表型在雄性和雌性小鼠中均被观察到，并且与初始恐惧记忆获取的年龄、恐惧获取与消退之间的间隔时间无关。

经历电击消退的Grin2b^C456Y/+小鼠表现出持久的焦虑样行为和社交缺陷

为了探究抑制的恐惧消退是否会诱发长期的焦虑样行为，研究团队对经历了恐惧获取和消退的小鼠进行了旷场、高架十字迷宫和三室社交测试。结果发现，与未经历电击的 na?ve 突变鼠相比，经历了“电击-消退”的Grin2b^C456Y/+小鼠在旷场中心停留时间显著减少，在高架十字迷宫开臂停留时间和进入次数也减少，表现出更明显的焦虑样行为。此外，它们在社交新奇识别测试中也表现出缺陷。这些结果表明，失败的恐惧消退过程能够导致长期且持续存在的焦虑和社交认知异常。

经历电击消退的Grin2b^C456Y/+小鼠基底杏仁核（BA）和前边缘下皮层（IL）神经元活动异常

为了找出导致上述行为表型的大脑区域，研究人员在远期恐惧记忆提取后进行了全脑c-fos染色。结果显示，在WT小鼠中，远期记忆提取能显著激活BA区域的神经元。然而，在Grin2b^C456Y/+小鼠中，这种提取诱导的BA神经元激活被“ occlusion 阻塞”（即没有变化）。相反，在IL区域，突变小鼠在记忆提取后表现出c-fos水平的降低，而WT小鼠则无显著变化。这些发现表明，BA和IL神经元在突变小鼠应对远期恐惧时出现了异常的活动模式。

经历电击消退的Grin2b^C456Y/+小鼠BA神经元自发性兴奋性突触传递受到抑制

接下来，研究通过电生理技术探究了突触功能的改变。在经历了“电击-消退”30天后（不进行记忆提取），研究人员发现WT小鼠的BA神经元其微型兴奋性突触后电流（mEPSC）的频率有所增加。 na?ve 的Grin2b^C456Y/+ BA神经元本身就表现出较高的基础mEPSC频率，但在经历“电击-消退”后，其频率并未出现WT那样的进一步增加。更重要的是，在记录网络活动下的自发兴奋性突触后电流（sEPSC）时，突变小鼠的BA神经元表现出比WT更低的频率。抑制性突触传递（mIPSC/sIPSC）在两组小鼠间则没有差异。IL神经元的兴奋性突触传递在两种基因型间均未表现出显著变化。这些结果表明，突变小鼠的BA神经元在经历恐惧消退后，其兴奋性突触功能发生了长期的、抑制性的适应不良。

经历电击消退的Grin2b^C456Y/+小鼠BA神经元兴奋性受到抑制

对神经元内在兴奋性的测量发现了更为深刻的差异。WT小鼠的BA神经元在经历“电击-消退”后，其兴奋性显著增强（表现为电流-放电曲线右移、阈值电流rheobase降低等）。然而，Grin2b^C456Y/+小鼠的BA神经元则完全缺乏这种“电击-消退”诱导的兴奋性增强。对NMDAR和AMPAR电流的测量发现，两者的比值在经历“电击-消退”后，在WT和突变小鼠中出现了同等程度的下降，表明NMDAR功能本身可能不是导致兴奋性差异的主要原因。这些电生理数据共同描绘了一幅图景：突变小鼠的BA神经元无法像WT神经元那样，在恐惧消退后有效地增强其兴奋性，这可能是其无法正常进行恐惧消退和表现出过度远期恐惧的细胞基础。

化学遗传学激活BA神经元可改善Grin2b^C456Y/+小鼠的恐惧记忆消退和远期恐惧记忆反应

基于以上发现，研究人员提出了一个因果性假设：BA神经元活动不足是导致突变小鼠恐惧消退缺陷和远期恐惧增强的关键原因。为了验证这一点，他们使用化学遗传学技术，在Grin2b^C456Y/+小鼠的BA CaMKIIα阳性神经元中特异性表达激活性DREADD受体（hM3Dq）。在恐惧消退训练期间，通过每日注射CNO来特异性激活这些BA神经元。结果发现，化学遗传学激活显著改善了突变小鼠的恐惧消退，其冻结水平在消退训练期间和30天后的远期记忆测试中均显著降低，达到了与WT小鼠相当的水平。这一操作对WT小鼠的恐惧行为影响较小。重要的是，这种激活只特异性改善了恐惧相关表型，并未缓解突变小鼠的焦虑样行为或社交缺陷，表明BA神经元对不同行为域的影响是分离的。

化学遗传学激活可 normalize Grin2b^C456Y/+小鼠BA神经元的自发性兴奋性突触传递和神经元兴奋性

为了探究行为改善背后的机制，研究人员在经历了“化学遗传学激活下的电击-消退”后，再次检测了BA神经元的电生理特性。他们发现，之前观察到的sEPSC频率的降低和神经元兴奋性的抑制，在CNO激活组的突变小鼠中都被成功地“ normalize 正常化”了，恢复到了与WT小鼠相似的水平。这表明，在恐惧消退的关键窗口期增强BA神经元的活性，可以逆转其长期功能抑制状态，从而为行为改善提供了直接的生理学证据。

综上所述，本研究揭示了Grin2b^C456Y/+ ASD模型小鼠存在显著的恐惧记忆消退障碍和增强的远期恐惧反应，其核心机制在于恐惧消退过程的失败导致基底杏仁核（BA）神经元发生长期的适应不良：包括自发性兴奋性突触传递的抑制和神经元内在兴奋性的降低。通过化学遗传学手段在恐惧消退期特异性增强BA神经元的活性，可以有效逆转这些细胞功能缺陷并挽救恐惧行为表型。

这项研究的发现具有多重重要意义。首先，它将一个特定的ASD风险基因（GRIN2B）与PTSD样的恐惧记忆病理表型直接联系起来，为理解ASD共病PTSD的机制提供了重要的临床前模型和分子靶点。其次，它深入揭示了从基因突变到神经环路功能异常，再到行为表型的完整因果链条，特别是强调了“恐惧消退失败”作为一个关键环节，如何引发杏仁核神经元的长期功能抑制。最后，研究证明了靶向特定脑区（BA）和特定时间窗口（消退期）的干预策略（如化学遗传学）的有效性，这不仅深化了我们对恐惧消退神经机制的理解，也为未来开发针对ASD患者创伤性恐惧记忆的精准神经调控疗法提供了新的思路和实验依据。