细胞外环境调控新皮质神经元命运与多样性的分子层级与机制研究

本研究针对细胞外环境如何调控新皮质神经元命运与多样性这一关键问题，通过建立基于分子身份的层级分类框架，系统比较了体内外不同条件下神经元成熟过程的转录组差异。研究发现细胞类型特异性身份在体内模型中保持稳定，但在体外2D培养中谷氨酸能神经元身份基因表达降低、多样性减少且连接性改变；器官型切片培养则能部分恢复体内特性。该研究揭示了细胞群体对环境线索的特异性响应，强调了细胞外环境在塑造新皮质细胞多样性中的关键作用，为理解神经发育障碍的基因-环境互作提供了新视角。

　　

大脑新皮质是哺乳动物神经系统的最高级中枢，其复杂功能依赖于高度多样化的细胞类型。这些细胞包括谷氨酸能神经元、GABA能神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等，它们通过精确的连接形成复杂神经网络。然而，这种惊人的细胞多样性是如何在发育过程中逐步形成的？细胞内在的遗传程序与外在的环境信号各自扮演着什么角色？特别是对于许多出生后仍在发育的神经元类型，外界输入如何影响其最终命运？这些问题的解答对于理解大脑发育的奥秘以及相关神经精神疾病的发病机制至关重要。

以往研究表明，某些皮质神经元类型对外界刺激特别敏感。例如，初级视觉皮层第2/3层神经元需要视觉输入来获得其身份，体感皮层第4层神经元需要触觉刺激来组织成为胡须相关的"桶状"结构。然而，对于大多数细胞群体而言，细胞外在因素（cell-extrinsic factors）对细胞命运和多样性的影响程度仍然未知。这类数据至关重要，因为许多神经精神疾病，包括自闭症谱系障碍，被认为是通过遗传和细胞外在因素之间的复杂相互作用而产生的。

为了解决这一科学问题，研究人员在《SCIENCE ADVANCES》上发表了最新研究成果。他们开发了一个基于分子身份的层级分类框架，系统地研究了细胞外在控制对细胞类型特异性命运的影响。通过比较不同条件下新皮质发育过程中细胞身份和多样性的展开情况，包括使用基因修饰小鼠模型改变细胞位置或神经支配的体内研究，以及使用二维培养和器官型切片培养的体外研究。

研究团队采用了多项关键技术方法：通过单细胞核RNA测序(snRNA-seq)技术建立了新皮质细胞的分子身份参考框架；利用Reeler突变小鼠模型(细胞位置异常)和VB^?小鼠模型(丘脑皮质神经支配中断)研究体内环境扰动效应；建立胚胎皮质二维培养和器官型切片培养系统进行体外研究；通过体外电生理记录和光遗传学技术分析神经环路连接特性；使用伪时间分析和多样性指数计算等生物信息学方法评估细胞成熟状态和多样性变化。

细胞群体特异性在新皮质中的成熟动态

研究人员首先通过无偏迭代聚类分析了成年小鼠初级体感皮层的单细胞转录组数据，建立了包含4个细胞类别、5个细胞亚类和13个细胞类型的层级分类系统。他们识别了1566个类别特异性转录本、1534个亚类特异性转录本和3452个类型特异性转录本，构建了"身份UMAP"参考空间，使细胞根据其身份基因的平均表达分布。发育时间序列分析显示，细胞身份的分层获得是逐步进行的：类别特征首先出现，随后是亚类和类型相关特征。谷氨酸能神经元比其他类型更晚达到成熟身份，表现出类型特异性的发育动态。

细胞类型特异性对Reeler和VB^?小鼠细胞外环境的敏感性

在Reeler小鼠(细胞位置改变)和VB^?小鼠(缺乏初级感觉丘脑输入)模型中，所有4个类别、5个亚类和13个类型都存在，细胞多样性保持良好。两种突变体都显示出更多身份未定义的细胞，主要位于L2/3 IT和L4 IT神经元簇之间。VB^?小鼠显示这些神经元类型的比例发生变化，L2/3 IT神经元增加而L4 IT神经元减少，表明L4 IT身份的定义减少。这些发现与先前研究一致，表明L4 IT神经元从L2/3 IT样神经元中出现是输入依赖性的。

二维培养中细胞群体特异性分子响应

在二维培养环境中，所有细胞类别都能够出现，但类别相对比例发生改变，谷氨酸能神经元比例减少。所有五个亚类都有良好的划分，但ET谷氨酸能神经元的比例显著降低。在类型水平上，许多细胞被分类为未定义，主要是在谷氨酸能类别内，反映了类型水平上细胞身份分子定义的降低。谷氨酸能类型显示出较低的细胞身份定义，表明未定义的身份是由于不完全获得而不是身份混合。因此，谷氨酸能神经元多样性减少，而非神经元细胞保持其身份定义和多样性。

二维培养中典型环路连接性受影响

研究人员检查了体内外分子身份与环路形成之间的双向关系。在体外，假定的L4 IT神经元和L2/3 IT神经元之间发现了相互连接，这与体内通常在L2/3 IT神经元之间发现的连接相似。这种双向连接表明假定的L4神经元获得了L2/3样环路特性，与分子分析显示的L2/3样转录特征一致。

器官型培养中增加细胞类型特异性谷氨酸能神经元身份定义

在器官型切片培养中，细胞群体在类别和亚类水平的分布更接近体内分布。更大比例的谷氨酸能神经元获得类型特异性身份，尽管没有完全匹配体内水平。相应地，谷氨酸能神经元类型多样性接近体内值。谷氨酸能神经元身份分子定义高于二维培养，关键转录本如IT神经元标记Cux2和Rorb以及ET神经元标记Bcl11b和Foxp2表达更高。器官型培养保留了建立和维持细胞类型特异性分子身份所需的关键外在线索。

研究结论和讨论部分强调，这项研究揭示了细胞类型特异性的外在影响对神经元命运的重要性。数据显示类别和亚类身份的显著稳健性，即使在二维分散培养中也能保持保守。生物信息学方法有助于跨条件比较细胞多样性，并可扩展到当前研究之外比较模型系统间的细胞身份。

在体内，细胞类型身份的获得仅受到细胞位置变化(Reeler小鼠)或输入(VB^?小鼠)的极小影响。然而在Reeler小鼠中，跨典型类型的细胞分布受到影响，表现为L2/3 IT神经元增加而L4 IT神经元减少。这可能反映了L4 IT神经元的不完全成熟，这些神经元最初具有L2/3 IT型分子身份，正常情况下以输入依赖性方式成熟成为L4 IT。

体外实验揭示了神经元类别特异性对身份获得外在线索的敏感性，谷氨酸能神经元比GABA能神经元更敏感。这种差异可能反映了本研究中使用定义细胞类型的分辨率阈值。类似地，星形胶质细胞在体外改变其特性，少突胶质细胞成熟高度依赖于培养条件。

器官型切片培养中细胞身份分子定义的改进强调了细胞外环境在决定神经元命运中的关键作用。这一发现支持外在调节在细胞分化中的重要性，并突出了先进3D培养系统(如类器官)在复制复杂神经组织方面的潜力。

虽然环境条件对神经元成熟的重要性先前已被确定，但本研究通过检查体内出生的细胞并直接比较来自共同起点的相同细胞群体 across 不同环境条件，采用了独特的方法。这种设计分离了对神经元成熟的特异性影响，而不是来自祖细胞的神经元生成的混淆效应。

这项工作补充了移植研究，其分子表征提供了一个框架来理解宿主环境线索如何对适当的神经元整合和功能至关重要。最后，对这些细胞外在因子依赖机制的进一步研究，包括活动在身份获得中的作用，可能确定神经发育障碍中新的治疗靶点，特别是那些受基因-环境相互作用影响的疾病。