WEE2基因多态性与ICSI受精失败风险关联研究：揭示女性不孕新机制

本研究首次在伊拉克人群中探讨WEE2基因rs1476640多态性与卵胞浆内单精子注射（ICSI）受精结局的关联，发现C等位基因显著增加受精失败风险（OR=9.06），为遗传性不孕的分子诊断和个体化治疗提供了重要依据。

　　

研究背景

人类生殖是一个复杂且精密调控的生物学过程，涉及配子成熟、受精、胚胎发育、囊胚形成、植入和活产等多个阶段。任何阶段的中断或停滞都可能导致生殖失败。不孕症定义为一年规律无保护性交后仍无法怀孕，全球约4800万对夫妇受其影响。随着不孕症发病率上升，越来越多夫妇求助于辅助生殖技术（ART），如体外受精（IVF）和卵胞浆内单精子注射（ICSI），但成功率仍不理想，部分原因与潜在遗传因素有关。遗传异常可导致高达30%的不孕病例。

女性生育能力关键取决于成功的卵子发生，即未成熟卵母细胞经过两次减数分裂（减数分裂I和II）产生单倍体配子。卵母细胞在减数分裂II期停滞，并在受精时完成该过程。卵母细胞成熟包括两个基本组成部分：核成熟（指通过减数分裂进行染色体减数）和胞质成熟（为卵母细胞受精、激活和早期胚胎发育做准备）。

WEE2基因（WEE1同源物2）位于染色体7q34，编码一个567个氨基酸的卵母细胞特异性激酶，属于WEE蛋白激酶家族。它由12个外显子组成，仅在卵母细胞和合子中表达。WEE2通过抑制成熟促进因子（MPF）和CDK失活，在GV期维持减数分裂停滞中起关键作用。此外，WEE2是受精过程中退出 metaphase II所必需的。WEE2表达减少与MPF活性升高和MII退出受损有关，导致原核形成和受精失败。

鉴于WEE2在卵母细胞成熟和受精中的关键作用，本研究旨在评估WEE2基因多态性与接受ICSI女性受精失败之间的关联。据我们所知，这是伊拉克首项调查WEE2遗传变异与受精结局关系的研究。

材料与方法

这项前瞻性比较研究于2024年10月至2025年2月在伊拉克巴比伦的Tibacenter不孕症中心进行。共纳入137名接受ICSI的不孕女性。符合条件的参与者是年龄20-35岁、原发或继发不孕持续2-10年的女性。所有参与者均接受ICSI周期。纳入标准包括无系统性疾病或染色体异常史。所有男性伴侣均接受标准精液分析。

进行全面的妇科和全身检查。基线生育能力评估包括月经周期第1天或第2天的激素分析，测量FSH、LH、雌二醇（E2）和孕酮（P4）。周期第2天进行经阴道超声检查以评估基线卵巢状态。

所有患者使用灵活GnRH拮抗剂方案进行卵巢刺激。在触发排卵后34-36小时通过经阴道超声引导抽吸进行取卵。同日收集精液样本并处理用于ICSI。

ICSI程序涉及将单个精子显微注射到每个成熟卵母细胞的细胞质中。注射后16-18小时通过存在两个原核（2PN）和两个极体（2PB）确认受精。异常受精定义为存在1PN、3PN或4PN。

胚胎分级在第3天基于标准形态学标准进行：I级：碎片<10%，阶段特异性细胞大小，无多核化；II级：碎片10-25%， mostly阶段特异性细胞大小，无多核化；III级：碎片>25%，细胞大小不规则，存在多核化。根据母亲年龄、胚胎质量和IVF史选择I级和II级胚胎进行子宫移植。

分子分析

采集外周静脉血（2 mL）置于EDTA管中，-20°C保存直至分析。使用标准酚-氯仿协议提取基因组DNA。通过NanoDrop分光光度法（BioDrop, UK）评估DNA数量和质量，读取260/280和260/230吸光度比。通过琼脂糖凝胶电泳确认DNA完整性。

使用NCBI Primer-BLAST设计WEE2基因rs1476640的引物，并使用BLAST针对人类基因组验证特异性。使用OligoCalc评估二级结构和自互补性。使用MFEprimer-2.0进行扩增子验证。

PCR优化退火温度和循环数。每个20 μL反应包括8 μL 2X Master Mix、1 μL正向引物（10 pmol）、1 μL反向引物（10 pmol）、2 μL基因组DNA（10-20 ng/μL）、0.5 μL MgCl₂（1%）和7.5 μL无核酸酶水。限制性消化前在琼脂糖凝胶上确认扩增产物。

使用NdeI酶消化对rs1476640 SNP进行基因分型。20 μL反应混合物包括5 μL PCR产物、1.5 μL酶缓冲液、0.5 μL NdeI和8 μL ddH₂O。片段在2.5%琼脂糖凝胶上分离，并在紫外光下可视化。

结果

孕妇和非孕妇组的平均年龄或BMI无统计学显著差异。不孕持续时间在孕妇和非孕妇组之间存在显著差异（p = 0.038）。孕妇和非孕妇组的总卵母细胞计数存在显著关联（p = 0.038）。子宫内膜厚度在孕妇和非孕妇组之间存在显著差异（p = 0.04）。

本研究使用PCR技术检测WEE2基因。凝胶电泳结果显示，与DNA ladder相比，WEE2基因的扩增子大小为329 bp。通过PCR-RFLP方法确定SNP rs1676760的基因型。

结果显示，孕妇组和非孕妇组之间存在显著的等位基因频率差异。共显性模型显示，TT（参考）在孕妇和非孕妇中分别为50.6%和18.3%，C/T分别为37.7%和43.3%，C/C分别为11.7%和38.3%（p < 0.0001）。显性C/T-C/C分别为39（50.6%）和49（81.7%）（p = 1e-04）。隐性C/C分别为9（11.7%）和23（38.3%）（p = 2e-04）。

孕妇和非孕妇组之间在生发泡（GV）卵母细胞方面存在显著差异（p < 0.001）。此外，在未成熟（metaphase I, MI）卵母细胞数量方面无显著差异。非孕妇组在生发泡（GV）卵母细胞方面存在统计学显著差异（p < 0.001）。然而，卵母细胞成熟阶段包括metaphase I（MI）在阴性组中无显著差异。

讨论

本研究调查了WEE2基因多态性与接受ICSI不孕女性受精结局之间的关联。结果显示，孕妇和非孕妇组的平均年龄或BMI无统计学显著差异，这与先前研究一致，表明在文化规范鼓励早婚的人群中，年龄和BMI可能不是ICSI成功的唯一预测因素。

然而，不孕持续时间与妊娠结局显著相关，与先前研究一致，表明长期不孕可能对ART程序的临床成功率产生负面影响。

重要的是，孕妇组获取的成熟卵母细胞数量显著更高，强化了卵母细胞产量与受精成功之间已确立的联系。子宫内膜厚度也与妊娠显著相关，较厚的子宫内膜与较高的植入率相关，与早期研究结果一致。

除了临床参数，我们的研究强调了遗传因素，特别是WEE2基因多态性，在决定ICSI结局中的关键作用。共显性模型显示，C/C和C/T基因型在非孕妇中更常见，而T/T基因型在实现妊娠的女性中更常见，表明T等位基因的保护作用和C等位基因的致病作用。这些观察结果与先前报告一致，这些报告将WEE2突变与总受精失败（TFF）联系起来， due to their impact on oocyte maturation and MII exit.

WEE2编码一种卵母细胞特异性激酶，调节GV期减数分裂停滞，并且在受精后退出metaphase II至关重要。WEE2的突变或表达减少会损害这一过程，导致异常卵母细胞激活和受精失败。研究表明，高达20.8%的TFF女性携带WEE2突变，而其他调查报告患病率约为6%。我们的发现支持这种关联，并强调了该基因在调节卵母细胞能力中的作用。

此外，数据与Jin等人（2021）的报告一致，他们在不明原因不孕患者中发现了复合杂合WEE2突变，其他研究证实WEE2缺陷可以阻止卵母细胞在GV期发育或阻断MII进展。

collectively，这些发现强调了WEE2在人类卵母细胞发育、减数分裂调节和成功受精中的重要性。识别该基因的多态性可以增强遗传性不孕的早期诊断，为患者咨询提供信息，并 potentially指导ART中的个体化治疗策略。

结论

WEE2基因多态性，特别是rs1476640变异，与接受ICSI女性的受精失败显著相关。C等位基因的存在可能通过破坏减数分裂过程损害卵母细胞成熟，从而降低受精潜力。WEE2变异的遗传筛查可能为识别ART失败风险患者和改善个体化不孕治疗方法提供宝贵工具。