摩洛哥特有白蒿精油的抗氧化、抗菌及毒性特征：地理起源对生物活性与分子机制的影响研究

本研究系统评估了摩洛哥三个地区（Oulad Ali Youssef、Serghina和Midelt）白蒿（Artemisia herba-alba Asso）精油的化学组成、生物活性及毒性，并结合分子对接技术揭示了其关键成分与靶酶（如1AJ6、6F0E和5M8Q）的相互作用机制。结果表明，精油具有显著抗氧化（DPPH法测定ARP达4.736±0.06）和广谱抗菌活性（MIC：0.6–5 mg/mL），且急性毒性试验显示其安全性良好。研究强调了地理因素对精油成分和功能的影响，为天然产物在医药和化妆品领域的应用提供了科学依据。

　　

引言

摩洛哥独特的地理位置、气候条件和多样化的土壤类型孕育了丰富的生物多样性，尤其是野生和栽培的芳香药用植物（AMPs）。这些植物几个世纪以来被用作治疗各种疾病的天然药物。其治疗功效主要归因于其次生代谢产物，包括生物碱、萜类和单宁等。萜类是植物中已知最大的次生代谢物类别，也是精油（EOs）的主要成分，在植物的防御和互惠相互作用中发挥关键作用。精油被广泛应用于香水、化妆品和制药工业。多项研究证实，精油在体外和体内具有多种生物活性，包括镇痛、抗聚集、抗凝血、解痉、抗炎、抗氧化、抗菌、抗真菌和抗癌特性。由于这些复杂的生物活性，精油引起了研究实验室和工业界的广泛关注，尤其是在开发具有功能或治疗潜力的天然产物方面。

白蒿（Artemisia herba alba，菊科）是一种药用芳香植物，全球有超过450种，主要分布在北非、中东、欧洲、亚洲和北美的部分地区。在摩洛哥，白蒿生长于阿特拉斯山脉、里夫地区和干旱草原。其精油从干燥的叶和枝中提取，具有多样的药理特性，包括抗炎、抗癌、镇痛、抗增殖、抗糖尿病、抗氧化、抗菌、松弛和杀虫作用。

白蒿精油的化学变异性已被多项研究证实。摩洛哥的研究显示，其主要成分如樟脑（17.5–55.31%）、α-侧柏酮（18.34%）、菊酮（28.10–47.71%）、菊乙酸酯（30.02%）、davanone（20–70%）、1,6-二甲基庚三烯（36.44%）、胡椒酮（85.68%）和vetivenic acid（14.9%）的含量因地理区域和收获季节而异。环境参数，包括植物的物候阶段以及生物和非生物胁迫因素，都可能影响精油化学型的质量和数量。尽管已有一些研究探讨了白蒿精油的生物效应，但非生物因素对其化学组成和生物活性的影响仍待深入探索。

本研究的原创性在于深入调查了地理起源对摩洛哥三个不同地区（Oulad Ali Youssef (AH1)、Serghina (AH2) 和 Midelt (AH3)）采收的精油特性的影响。通过结合分析化学、实验生物学和分子对接技术，我们鉴定了主要的生物活性成分，并评估了它们的抗氧化、抗菌和抗真菌活性。整合分子对接以模拟这些化合物与特定靶蛋白之间的相互作用，是一种创新且精确的方法。这项研究为生态因素如何影响精油的质量和功效提供了新的见解，同时为其在治疗和化妆品应用开辟了有前景的途径。

材料与方法

植物材料与研究区域

研究在摩洛哥的两个省份Midelt和Boulemane进行，这两个地区以其生态多样性闻名。Midelt位于Draa-Tafilalet地区，坐落在高阿特拉斯和中阿特拉斯山脉之间，海拔1521米，属于干旱至半干旱气候，拥有丰富的水系和多样的植物群。Boulemane位于Fès-Meknès地区，主要是农村，Serghina（海拔677米）和Oulad Ali Youssef（海拔870米）是其焦点。两个市镇都具有半干旱气候、山地地形和经济以农业为主。

2019年7月，从以下三个地区采集了白蒿（Artemisia herba alba Asso）的花序顶部样本：Midelt、Oulad Ali Youssef和Serghina。样本在室温（25°C）下干燥10天。植物鉴定通过宏观比较参考标本和分类学键进行，并由摩洛哥拉巴特科学研究所的Hamid Khamar教授确认。凭证标本保存在拉巴特科学研究所国家植物标本馆，凭证编号为RAB114635（来自Midelt的白蒿）和RAB114634（来自Oulad Ali Youssef和Serghina的白蒿）。

化学品与试剂

乙醇和乙酸购自Merck（达姆施塔特，德国）。2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）、抗坏血酸和氢氧化钾（KOH）购自Sigma Aldrich（圣路易斯，密苏里州，美国）。碘化钾（GPR Rectapur级，VWR International BV，鲁汶，弗拉芒布拉班特，比利时）和wijs试剂（分析级）来自VWR International（BDH Prolabo，鲁汶，比利时）。酚酞指示剂、氯仿和无水硫代硫酸钠购自Loba Chemie Pvt. Ltd.（孟买，印度）。

精油的提取

白蒿的精油通过水蒸馏法提取。具体地，将100克干燥的花序尖端与1升蒸馏水混合在圆底烧瓶中，配备冷凝器和Clevenger型装置（P.D.Scientific Glass Works，安巴拉坎特，哈里亚纳邦，印度）。混合物加热至85°C，蒸馏3小时。蒸馏过程中，挥发性化合物随蒸汽被带走，然后冷凝。由于精油的密度低于水，其在Clevenger装置中分离，被收集并储存在4°C的琥珀色玻璃小瓶（Confort Lab，梅克内斯，摩洛哥）中。白蒿精油的产率以毫升每100克干燥植物材料表示。

感官特性

提取的白蒿精油的感官特性基于颜色（视觉感知）、气味（嗅觉感知）和外观（视觉和触觉感知）等感官参数确定。评估由第一作者在受控实验室条件下进行，借鉴了精油分析的专业知识，并由论文导师进行第二次独立读取以确保客观性。

理化性质

进行了一系列理化测试，包括相对密度、酸度、过氧化值和碘值，使用先前报道的方法。20°C下的相对密度根据NF T 75–111标准使用电子精密天平（Nahita Blue，系列5133，容量100克，精度0.001克）测定。酸度通过测定中和一克油中游离脂肪酸所需的氢氧化钾（KOH）量，按照ISO 729:1988协议测量。过氧化值通过碘量滴定法根据ISO 3960:2017标准测定。碘值使用Wijs方法根据Noudogbessi等人描述的协议测定。

精油的化学组成

精油通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）在穆莱·伊斯梅尔大学科学学院的分析中心进行分析。CG分析使用Hewlett-Packard气相色谱仪（6890系列）耦合质谱仪（HP 5973系列）。碎裂通过电子轰击在70 eV能量下进行。CG系统配备分流进样器和涂有DB-5固定相（5%苯基-甲基-聚硅氧烷）的熔融石英柱。氮气作为载气，流速为1 mL/min。色谱分离在DB-5 MS柱（30 m × 0.25 mm，膜厚：0.25 μm）上进行。柱温程序从50°C升至200°C，升温速率为4°C/min。设备连接到配备NIST 98质谱库的数据系统。

成分的鉴定基于其计算的Kovats指数与数据库中标准化合物的比较。此外，参考了美国国家标准与技术研究院（NIST）。Kovats指数使用公式计算。

自由基清除（DPPH*）测定

精油的抗氧化活性使用DPPH自由基清除测定评估。将不同体积的精油（0–100 μL）用乙醇调整至200 μL，与2.8 mL DPPH溶液（24 μg/mL于乙醇中）混合。混合物在暗处孵育30分钟，使用紫外-可见分光光度计（VWR?，V-1200，可见分光光度计）在515 nm测量吸光度。乙醇作为阴性对照。抑制百分比（PI）使用公式计算。

为了评估抗氧化潜力，计算了IC₅₀、EC₅₀和ARP参数。IC₅₀表示抑制50% DPPH自由基所需的样品浓度，以mg/mL表示。EC₅₀使用公式确定，量化相同抑制所需的有效浓度。抗氧化反应参数（ARP）是抗氧化能力的稳健度量，使用公式计算。

抗菌活性

从白蒿花序顶部提取的精油测试了其对九种细菌菌株（革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌）和七种真菌菌株（酵母和霉菌）的抗菌活性。细菌菌株包括革兰阳性球菌（表皮葡萄球菌 (5994)、金黄色葡萄球菌 (4IH2510)、无乳链球菌 (7DT1887)）和革兰阴性杆菌（野生型大肠杆菌 (3DT1938)、产BLSE大肠杆菌 (2DT2057)、阴沟肠杆菌 (02EV317)、肺炎克雷伯菌 (3DT1823)、奇异变形杆菌 (2DS5461)和铜绿假单胞菌 (2DT2138)）。真菌菌株包括酵母白色念珠菌 (Ca)、都柏林念珠菌 (Cd)、酿酒酵母 (Sacc)、热带念珠菌 (Ct)、克鲁斯念珠菌 (Ckr)和近平滑念珠菌 (Cpa)，以及霉菌黑曲霉 (AspN)。这些菌株在穆罕默德五世省立医院（梅克内斯）鉴定。此外，分析了来自CHIS拉巴特Ibn Sina医院寄生虫学实验室真菌学收藏的分离株的抗菌活性。

白蒿精油的抗菌活性使用96孔微板中的微稀释法评估。最低抑菌浓度（MIC），定义为抑制可见微生物生长的最低浓度，通过孵育后视觉检查确定。精油和提取物的系列稀释在10%二甲基亚砜（DMSO）中制备，浓度范围从5到0.93 × 10^?2 mg/mL。对于每个浓度，100 μL稀释的精油加入100 μL沙氏肉汤（用于真菌）或Mueller-Hinton培养基（用于细菌）。然后向每孔加入微生物接种物，最终浓度对于细菌为10⁶ CFU/mL，对于真菌为10⁴ CFU/mL。在37°C孵育24小时后，通过向每孔加入10 μl刃天青评估细菌生长。在随后的2小时孵育后，颜色从紫色变为粉红色表示微生物生长。MIC确定为未观察到刃天青颜色变化的最低浓度。生长和无菌对照分别在11和12孔中进行。所有测试重复进行。特比萘芬作为阳性抗真菌对照，通过将研磨的化合物溶解在10% DMSO中至250 mg/mL浓度制备。

为了确定最小杀菌浓度（MBC）和最小杀菌浓度（MFC），从未显示可见生长的孔中取10 μL等分试样，铺在Mueller-Hinton琼脂（细菌）或沙氏琼脂（真菌）上。在37°C孵育24小时后，MBC/MFC定义为与生长对照相比实现99.99%菌落形成单位（CFU/mL）减少的最低浓度。MBC/MIC或MFC/MIC比率将化合物的效应分类为杀菌/杀真菌（比率 ≤ 4，比率为1表示绝对活性）或抑菌/抑真菌（比率 > 4）。

急性毒性

使用来自国家药用和芳香植物局（Taounate，摩洛哥）药理学系动物房的体重在25至35克之间的白化小鼠进行本研究。小鼠在受控条件下饲养，温度为22 ± 2°C，12小时光/暗循环，自由获取食物和水。所有涉及小鼠的程序均遵循美国国立卫生研究院概述的国际公认的实验室动物护理和使用指南。

白蒿精油的急性口服毒性在白化小鼠（20–35克）两性中研究。动物随机分为四组，每组六只小鼠，治疗前禁食14小时。溶解在5%明胶溶液中的精油通过灌胃口服给药，剂量为0.5、1和2 g/kg体重。对照组接受10 mL/kg蒸馏水。观察动物30分钟，随后10小时每小时一次，以及接下来的14天每天观察毒性迹象，包括行为变化、体重减轻和死亡率。

Glide分子对接

抗菌、抗真菌和抗氧化蛋白（PDB ID: 1AJ6、6F0E和5M8Q）的晶体结构从RCSB蛋白质数据库获取。使用Maestro平台的蛋白质准备向导模块准备蛋白质结构。该模块分配任务以准备键序、添加氢原子、形成金属的零级键、创建二硫键、将硒代蛋氨酸转化为蛋氨酸，并完成缺失的侧链。结构通过能量最小化优化，随后在OPLS4力场下进行氢键优化。Maestro平台的LigPrep模块负责准备目标蛋白质的共结晶配体和从白蒿精油中分离的成分。共结晶配体由BIOVIA Discovery Studio设计。

目标蛋白质和配体分子的Glide对接通过Maestro平台的Glide对接模块进行。SP姿势查看器分析对接的配体和蛋白质相互作用，然后生成最佳姿势。配体相互作用模块可视化配体-蛋白质复合物分子的2D相互作用图。

统计学

结果以均值±标准误（SEM）给出。统计差异使用方差分析（ANOVA）评估，随后进行Tukey-Kramer多重比较事后检验，使用GraphPad Prism版本8.0进行。统计显著性设定为p < .05。关于三个地点精油22种主要成分的化学变异性结果使用R软件分析。主成分分析（PCA）使用Pearson矩阵进行，而层次聚类分析（HCA）使用通过欧几里得距离计算的不相似性矩阵进行。

结果与讨论

精油的产率

研究的三个白蒿样本的提取产率总结在表中。三个样本（AH1、AH2、AH3）的提取精油产率分别为1.02 ± 0.08%、0.78 ± 0.03%和1.19 ± 0.05%。结果显示在p < .05水平有显著差异，这可能 due to气候变异或其他环境因素。与其他研究相比，我们的结果显示比摩洛哥中阿特拉斯3月采集的白蒿（0.49%）和Imizar Azilal、摩洛哥（0.6%）更高的产率。相反，我们的产率显著低于摩洛哥中阿特拉斯白蒿（1.74%和1.30%）、摩洛哥Timahdit（2.2%）和阿尔及利亚Medjbara（1.5%）。然而，我们的结果与来自摩洛哥Taounate的白蒿（1%）以及来自Serghina和Oulad Ali Youssef、摩洛哥的白蒿（分别为1%和0.9%）报告的产率一致。类似产率也在摩洛哥Taroudant（0.71%）观察到。

样本AH1、AH2和AH3的精油产率范围从1.19%到0.78%。最高产率（1.19%）在海拔1521米处测量，而最低产率（0.78%）在海拔677米处观察到。结果表明海拔与精油产率之间存在正相关，这与Sabbahi等人（2020）的结果一致。然而，与我们的结果相反，?ner和Ye?il（2023）的研究表明精油产率随海拔增加而降低。考虑到这些结果，可以合理推测我们研究中观察到的精油产率差异并非 solely due to海拔。其他贡献因素可能包括气温、干燥时间、光照强度、土壤条件或植物的营养阶段。

感官特性

感官特性数据列于表中。从Oulad Ali Youssef、Serghina和Midelt采集的白蒿精油通过水蒸馏法获得，表现出不同的特性。它们的颜色范围从Oulad Ali Youssef的黄橙色、Serghina的浅橙色到Midelt的深黄色。在外观上，油清澈透明，质地从粘稠到液体不等。在气味方面，来自Oulad Ali Youssef和Midelt的油散发出新鲜、樟脑般的香气，而来自Serghina的油具有强烈而愉悦的气味。这些感官特性的差异可归因于植物发育、提取过程和精油储存等因素的复杂相互作用。

理化性质

研究了来自摩洛哥三个地区——Oulad Ali Youssef (AH1)、Serghina (AH2) 和 Midelt (AH3) ——的白蒿（AH）精油的理化性质。使用统计比较（ANOVA，Tukey检验）评估显著差异。相对密度（AH1: 0.92 ± 0.007, AH2: 0.92 ± 0.01, AH3: 0.91 ± 0.007）符合AFNOR精油在20°C的标准（0.87–0.97），并且显示无显著差异（p = .649），表明为单一同质组（AH1 = AH2 = AH3 = “A”）。酸度值（AH1: 5.51 ± 0.14, AH2: 5.05 ± 0.79, AH3: 5.498 ± 0.15 mg KOH/g oil）在AFNOR（法国标准化协会）限值内（< 10%），确认了油的稳定性。相应地，统计分析显示无显著差异（p = .283），将所有样本归入同一类别“A”（AH1 = AH2 = AH3 = “A”）。

过氧化值是评估精油质量的关键参数，因为它测量氢过氧化物的浓度，这是油中的主要氧化产物。通常，高过氧化值表明显著的氢过氧化物形成，暗示油的氧化，而低值反映良好的油质量。我们的结果对于AH1、AH2和AH3分别为10.2 ± 0.3、15.4 ± 0.8和18.2 ± 0.3 meq O?/kg oil。所有值均低于国际橄榄理事会（IOC）设定的20 meq O?/kg限值，表明可接受的稳定性。然而，发现样本之间存在显著差异（p = .0081）。特别是，AH1的过氧化值显著低于AH2和AH3，后者形成单独组（AH2 = AH3 = “A”; AH1 = “B”）。

碘值反映了不饱和度和对氧化的敏感性。较高的碘值表明油中双键数量较多，使其更容易发生氧化酸败。它还有助于基于干燥能力对油进行分类：干燥油的值高于150，半干性油在100至150之间，非干性油在70至100之间。我们的结果显示对于AH1、AH2和AH3分别为84.64 ± 0.89、80.58 ± 1.25和97.71 ± 1.79 g I?/100 g oil。所有值均低于100 g I?/100 g oil，这将油分类为非干性，因此不易发生氧化酸败。尽管如此，建议适当储存以最小化氧化。统计分析揭示了显著差异（p = .002）。AH3的碘值显著高于AH1和AH2，导致两个 distinct组（AH1 = AH2 = “B”; AH3 = “A”）。

这项研究显示了三个地区白蒿精油在酸度和相对密度方面的同质性。然而，在碘值和过氧化值方面观察到显著的地区差异。

白蒿精油的化学组成

表显示了通过GC-MS分析的每种精油样本的化学组成。来自Oulad Ali Youssef地区（AH1）的精油化学分析揭示了31种化合物的存在，占精油总成分的100%。白蒿（AH1）精油的特征是樟脑（19.59%）、反式-侧柏酮（11.67%）、松油烯-4-醇（9.6%）、davana-醚（6.01%）和邻-伞花烃（5.28%）作为主要成分。该油主要由含氧单萜（62.10%）组成，其次是单萜（19.4%）和含氧倍半萜（15.08%）。微量成分占总组成的3.42%，而未检测到倍半萜。该油的特征是酮类比例高（39.80%），其次是醇类（24.07%）、烃类（19.40%）、醚类（7.09%）和酯类（3.42%），而醛类（2.32%）和环氧化物（2.14%）仅少量存在。这些结果与Younsi等人（2016）的结果一致，他们鉴定出β-侧柏酮（41.9%）、α-侧柏酮（18.4%）和樟脑（13.2%）作为来自突尼斯Kairouan地区白蒿精油的主要成分。

关于来自Midelt地区（AH3）的白蒿精油的化学组成，共鉴定出35种化合物，占油化学成分的100%。主要成分包括反式-侧柏酮（28.53%）、樟脑（13.2%）、胡椒烯酮（6.7%）、1,8-桉树脑（5.71%）和比萨波醇氧化物A <α>; (5.41%)。已鉴定化合物中最丰富的类别是含氧单萜，占72.36%，而烃类单萜含量较低（9.58%）。含氧倍半萜占11.16%，并且鉴定出痕量倍半萜（2.17%）。

AH3的化学谱显示酮类比例高（62.33%），其次是醇类（15.41%）和烃类（12.7%）。醚类占总组成的5.71%，酯类占2.86%，而环氧化物仅占0.99%。这些结果与Mighri等人（2010）的结果一致，他们鉴定出β-侧柏酮、α-侧柏酮、樟脑和1,8-桉树脑作为生长在突尼斯干旱地区的白蒿精油的主要成分。

此外，对来自Serghina（AH2）的白蒿精油的化学组成分析鉴定出23种化合物，占化学成分总量的89.98%。该精油（AH2）的特征是异常高比例的davana醚（23.18%），其次是davanone（14.02%）、vetivenic acid（10.08%）、laciniata furanone H（6.65%）和匙叶桉油烯醇（4.87%）。该样本的化学谱主要由含氧倍半萜（79.6%）组成，其次是其他化学化合物（8.67%）、含氧单萜（1.32%）、倍半萜（0.39%）和完全不存在单萜。该精油还以酮类比例高（43.84%）为特征，其次是醚类（24.84%）和羧酸（10.08%）。醇类占总组成的9.28%，而环氧化物、酯类和烃类分别占0.93%、0.62%和0.39%。这些结果与Amine等人（2022）的结果一致，他们发现来自同一研究区域（Serghina）的白蒿精油的主要化合物是vetivenic acid（14.9%）、davana醚（14.7%）和davanone（13.6%）。

在摩洛哥进行了几项关于白蒿的化学研究，揭示了众多主要化学化合物的存在。然而，来自Serghina地区的白蒿的主要成分值得注意，因为鉴定出了新化合物，如davana醚和davanone，这是这种新表征精油的关键元素。在分析和比较了三个白蒿样本（AH1、AH2和AH3）的精油化学组成后，我们发现AH1和AH3主要由单萜（含氧和烃类）组成，分别占其组成的81.5%和81.94%，以樟脑和反式-侧柏酮为主要成分。相反，AH2以倍半萜（烃类和含氧）为主，占总组成的79.99%。这些化学家族的差异可能影响这些样本的药理活性。

单萜以其抗感染特性（杀菌、杀病毒和杀真菌）而闻名，而倍半萜与抗高血压、镇静、抗真菌和抗炎作用相关。此外，某些化合物如酚类、醇类、醚类、酮类、醛类和单萜在精油的抗菌和抗氧化活性中起关键作用。地理位置、同一国家内采集点之间的气候差异以及其他环境因素都有助于确定目标植物精油的化学型。因此，观察到的白蒿精油化学组成的差异可以通过植物对非生物因素的适应来解释，例如各自采集地的特定气候。

主成分分析和聚类热图

所研究蒿属物种的精油（EOs）在定性和定量组成方面都表现出显著的化学多样性。为了探索这种化学变异性及其与起源地区的潜在相关性，我们进行了统计分析，包括主成分分析（PCA）和热图聚类。对于PCA，选择了前两个因子轴。在这两个轴形成的平面内，关于所选变量的分析样本（AH1、AH2和AH3）的分散占总变异的87.7%。具体而言，第一轴解释了57.3%的变异，而第二轴贡献了30.4%。PCA结果揭示了存在两个具有相似化学谱的 distinct组。此外，分析强调了三个起源地区精油化学组成的一定程度的异质性。

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  第1组以AH1和AH3的精油为特征，它们与樟脑和反式-侧柏酮呈正相关。

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  第2组则以AH2的EO为代表，它与davana醚、davanone和vetivenic acid呈负相关。

这些发现强调了地区对精油化学组成的影响，并提供了与不同蒿属样本相关的独特化学谱的见解。

图显示了一个热图分析，说明了所研究每个物种鉴定出的主要化合物的相对丰度。红色、深黄色和绿色分别用于指示高、中、低丰度。该热图确认了基于鉴定出的主要成分通过主成分分析（PCA）描述的精油（EOs）分为两个簇。热图顶部和左侧的两个树状图显示，第1组由EO AH2组成，其特征是富含davana醚、davanone和vetivenic acid。第二组包括EO AH1和AH3，其化学组成在鉴定出的主要成分方面几乎同质。

抗氧化活性

使用DPPH自由基清除测定评估了蒿属精油的抗氧化潜力，并以IC₅₀、EC₅₀和ARP值表示。特别是，从IC₅₀值计算出的ARP值是自由基清除活性的稳健且可重复的指标，允许与文献数据进行严格比较。因此，高ARP值证实了这些精油在中和自由基方面的有效性。此外，通过ARP测量的抗氧化能力评估显示，所研究不同地区蒿属精油之间存在显著的异质性。特别是，来自Midelt（AH3）的油显示出显著更高的抗氧化活性（ARP = 4.73 ± 0.06），其次是来自Serghina（AH2; ARP = 1.11 ± 0.08）和Oulad Ali Youssef（AH1; ARP = 0.73 ± 0.02）的油。这一观察表明，风土对精油的化学组成有显著影响，因此也影响其抗氧化潜力。尽管蒿属油的抗氧化活性各不相同，但它仍然低于抗坏血酸（ARP = 789.36 ± 79.67）。这种差异可能归因于抗氧化机制的复杂性，这通常涉及不同酚类化合物之间的协同作用。此外，蒿属精油的比较分析显示，其含氧单萜和倍半萜的含量与其抗氧化活性之间存在正相关，正如Gonzalez-Burgos等人