基于纳米孔宏条形码技术揭示柬埔寨犬源亚洲恶丝虫（Dirofilaria asiatica）的基因特征及人兽共患传播风险

本文利用新型纳米孔测序宏条形码技术，首次在柬埔寨犬群中系统鉴定出人兽共患寄生虫亚洲恶丝虫（D. asiatica），揭示其4%的地方性流行率及与南亚流行株的遗传同源性，为东南亚地区人兽共患丝虫病防控提供关键分子流行病学依据。

　　

引言

丝虫类线虫（Filarioid nematodes）作为重要的媒介传播病原体，可感染人类和动物，其中多种物种具有人兽共患传播特性。近年来，一种曾被命名为"Dirofilaria sp. Hong Kong genotype"的人兽共患丝虫在东南亚旅行者病例中频繁出现，后被正式鉴定为新物种——亚洲恶丝虫（Dirofilaria asiatica）。然而，该寄生虫在亚洲地区的流行病学特征仍不明确。柬埔寨作为东南亚国家，拥有约500万只自由活动的半家养犬只，多数缺乏兽医护理，为虫媒疾病的传播提供了潜在条件。虽然前期研究曾报道当地存在多种虫媒病原体，但对丝虫类寄生虫的系统研究仍极为有限。

材料与方法

本研究采用横断面调查设计，在柬埔寨五个地区（金边、磅清扬、暹粒、马德望和特本克蒙）采集504份犬血样本。通过样本量计算公式（n = z2p(1-P)/d2）确定最小样本量为207只，其中预期流行率参数参考了前期研究的16%数据。样本采集覆盖旱季和雨季两个 monsoon 季节，所有样本经静脉穿刺收集于EDTA抗凝管，低温保存后运送至墨尔本大学进行后续分析。

DNA提取使用DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒，采用200μL全血样本，通过30分钟蛋白酶K消化和两步洗脱获得50μL总DNA。预筛选采用常规PCR（cPCR）方法，使用COIfilF/COIfilR引物对扩增约650bp的cox1基因片段，阳性样本进而进行纳米孔宏条形码测序。测序在MinION Mk1b平台上进行，使用Guppy v6.4.6进行碱基识别，原始数据通过NanoCLUST流程进行生物信息学分析。系统发育分析采用贝叶斯推断（MrBayes 3.2.7）和邻接法（MEGA 11），使用线粒体cox1基因序列构建进化树，并利用PopART软件构建最小跨度网络。

结果

样本特征显示504只犬中雄性占52.4%，雌性占45.4%，绝大多数（97.6%）为混血品种。外寄生虫感染率高达74.2%。通过预筛选发现89份样本呈现扩增条带，经纳米孔测序最终鉴定出5例丝虫阳性感染，总流行率为1%（95% CI: 0.4%-2.3%）。其中4例为亚洲恶丝虫（D. asiatica），集中分布于特本克蒙地区，当地流行率达4%（95% CI: 1.6%-9.8%）；另1例为隐藏棘头线虫（Acanthocheilonema reconditum），总流行率0.2%（95% CI: 0%-1%）。值得注意的是，本研究未发现犬心丝虫（D. immitis）或匍行恶丝虫（D. repens）感染。

测序数据量达3.19百万条原始读长（87.01 GB），经质控过滤后保留86.7%的有效数据。阳性样本中丝虫特异性读长占比极高（64.1%-99.7%），经Blastn比对显示与亚洲恶丝虫参考序列（NC_031365.1等）同源性达99.56%-99.85%。系统发育分析显示，柬埔寨分离株与不丹、香港、印度和斯里兰卡的人畜分离株形成高支持度聚类（后验概率0.97，自举值99%），且与匍行恶丝虫明显分化。单倍型网络分析揭示亚洲恶丝虫存在一定遗传多样性，柬埔寨序列与泰国人脸部感染病例（PP442028.1）属于独特进化分支。

讨论

本研究首次在柬埔寨犬群中证实亚洲恶丝虫的地方性流行，其4%的流行率与年龄、性别等风险因素相关（75%感染犬为雄性，50%为幼犬）。空间分布显示该寄生虫呈现聚集性分布特征，仅见于特本克蒙地区，这种现象与欧洲恶丝虫研究的发现一致，可能与媒介蚊虫繁殖所需的特定环境条件有关。与前期Inpankaew等报道的15.8%犬心丝虫流行率差异，可能源于研究方法学差异——传统PCR方法在亚洲恶丝虫发现前建立，可能无法有效区分这种隐秘物种。

亚洲恶丝虫的人兽共患特性值得高度警惕。虽然感染犬只通常不表现临床症状，但人类感染后可出现皮下结节、结膜下感染、眼部炎症等病变，甚至手术切除后发生过敏反应。柬埔寨自2005年实施的淋巴丝虫病大规模药物治疗（MDA）计划已于2016年因达到消除标准而终止，这使得人群对该寄生虫的易感性增加。尽管目前尚无柬埔寨人类感染病例报告，但症状易与其他疾病混淆且疾病报告系统不完善，实际风险可能被低估。

分子进化分析表明，柬埔寨分离株与南亚地区流行株遗传关系密切，但存在地区特异性变异。与匍行恶丝虫相比，亚洲恶丝虫遗传多样性较低，这可能反映其较晚的发现时间和有限的研究深度。值得注意的是，东南亚地区还存在其他未被充分鉴定的丝虫物种，如"Dirofilaria sp. Thailand II"等，提示该地区丝虫多样性可能远超当前认知。

方法论上，纳米孔宏条形码技术展现出传统方法无法比拟的优势。这种无偏倚的检测策略能够同时识别共感染、罕见种和隐秘物种，特别适用于病原体多样性不明的地区。相比只能检测已知病原体的常规PCR和qPCR，宏条形码技术通过泛丝虫引物扩增和长读长测序，为寄生虫群落研究提供了全新视角。

针对丝虫感染的防控，研究建议采用莫西克丁（moxidectin）或米尔倍霉素（milbemycin oxime）等杀微丝蚴药物，结合吡虫啉（imidacloprid）/氯菊酯（permethrin）等驱虫剂进行化学预防。这种联合用药方案已被证明对恶丝虫有效，同时能预防蜱传疾病（如血小板无形体、巴贝斯虫、犬埃立克体等），在热带地区具有综合保护效益。

结论

本研究通过高通量宏条形码技术首次系统描绘了柬埔寨犬丝虫病的流行病学图景，证实亚洲恶丝虫的地方性流行及其人兽共患风险。研究发现强调需要进一步调查该寄生虫的分布范围及相关环境决定因素，同时建议临床医生提高对这一隐秘人兽共患病原体的认知，在淋巴丝虫病MDA计划终止的背景下，开展针对性监测和防控措施。