ATR激酶抑制剂Elimusertib单药及联合治疗在DNA损伤应答通路及基因组变异肿瘤中的疗效研究

本综述系统评估了ATR激酶抑制剂Elimusertib在携带DNA损伤应答（DDR）通路变异肿瘤模型中的抗肿瘤效果。研究通过患者来源异种移植（PDX）模型证实，Elimusertib单药或与PI3K抑制剂Copanlisib、PARP抑制剂Niraparib联用，可显著延长无事件生存期（EFS-2），并在PARP抑制剂耐药模型中仍保持活性。研究揭示了PI3K/AKT/mTOR通路激活与治疗响应的潜在关联，为精准靶向治疗提供了新策略。

　　

摘要

ATR（ataxia telangiectasia and RAD3-related）激酶与ATM（ataxia telangiectasia–mutated）激酶协同作为DNA损伤应答（DDR）的关键调控因子。本研究通过患者来源异种移植（PDX）模型评估了ATR抑制剂Elimusertib（BAY-1895344）在携带DDR通路变异肿瘤中的抗肿瘤效果。疗效通过肿瘤体积（TV）相对于基线的变化进行评估，响应标准包括：部分响应（PR，TV减少≥30%）、疾病进展（PD，TV增加≥20%）和疾病稳定（SD）。无事件生存期定义为肿瘤体积倍增时间（EFS-2）。在21个PDX模型中，11个模型显示Elimusertib单药治疗显著延长EFS-2，其中4个达到PR，4个为SD。响应见于ATM免疫组化（IHC）缺失的模型（5个中的2个）以及携带BRCA1/2、ATM等DDR基因变异的模型。Elimusertib在5个已知PARP抑制剂（PARPi）耐药的模型中的3个延长了EFS-2。四个PDX模型的药效学研究表明DNA损伤标志物增加，其中两个模型显示PI3K/mTOR通路信号增强。Elimusertib与PI3K抑制剂Copanlisib联用在11个模型中的3个增强了EFS-2；与PARPi Niraparib联用在PARPi耐药PDX模型中显示出比单药更强的抗肿瘤活性。研究表明ATR抑制具有抗肿瘤活性，包括在内在和获得性PARPi耐药模型中，但需进一步优化患者选择策略。

引言

ATR激酶是DDR的核心组分，与ATM激酶协同响应单链和双链断裂以及停滞的复制叉。复制应激触发这些事件，招募并激活ATR和ATM至DNA损伤位点，进而促进细胞周期阻滞和阻止复制起点 firing。由于ATM和ATR在DNA损伤修复中的协同性和冗余性，一个通路的改变可能导致另一个通路的激活增强。ATR通路的功能缺失突变罕见，表明其对细胞生存至关重要，而ATM基因在肿瘤细胞中频繁突变。ATM缺失或缺陷可能增加对ATR信号的依赖，临床前研究显示ATR抑制与ATM缺失具有合成致死性。因此，ATR成为治疗靶点，重点关注ATM缺失或其他DDR基因变异的肿瘤。

ATR激酶抑制剂Elimusertib（BAY-1895344）在临床前模型中显示出单药及联合疗效，特别是与PARP抑制剂联用具有协同抗肿瘤活性。临床研究显示Elimusertib在经治晚期实体瘤患者中具有抗肿瘤活性，一期和二期研究探索了ATR激酶抑制与其他DDR抑制剂如PARPi和化疗药物的联合，初步结果显示临床活性，值得进一步研究。

本研究旨在评估Elimusertib单药及联合治疗在携带多样DDR通路变异的PDX模型中的疗效。研究发现Elimusertib通过调控DDR通路，在特定PDX模型中稳定疾病或诱导肿瘤消退，并评估了治疗后的下游分子变化，探索了与PI3K抑制剂Copanlisib或PARPi Niraparib的理性联合。

材料与方法

体内实验

动物实验经德克萨斯大学MD安德森癌症中心机构动物护理和使用委员会批准。PDX模型来源于患者肿瘤样本，皮下植入雌性NOD/SCID gamma小鼠，随后在athymic nu/nu小鼠中传代。治疗研究选自超过250个PDX模型的生物库，富集了DDR变异，重点关注ATM突变和缺失作为响应预测因子。模型选择包括多个已知对他拉唑帕利（talazoparib）敏感的模型。基于ATR抑制剂在ARID1A变异子宫内膜癌中的活性报告，从NCI患者来源模型库中获取了ATR突变子宫内膜癌PDX模型MD1734。

治疗测试中，植入肿瘤体积达200至400 mm³时开始治疗，所有实验组在治疗开始时平均肿瘤体积相似。小鼠在达到实验终点或肿瘤体积达2000 mm³时处死。肿瘤生长抑制依据NCI患者来源异种移植网络指南定义。肿瘤体积（Vt）计算公式为Vt（mm³）=[(宽度)²×长度]/2，相对于基线的百分比变化计算为（第0天Vt－第X天Vt）/第0天Vt。TV减少≥30%定义为PR，增加≥20%定义为PD，非PR非PD定义为SD。相对治疗对照（T/C）比计算为（治疗组第21天Vt/第0天Vt）/（对照组第21天Vt/第0天Vt）。EFS-2定义为肿瘤体积从基线倍增的时间，EFS-2比计算为治疗组EFS-2/对照组EFS-2，通过Kaplan-Meier分析比较。

体内治疗

小鼠随机分组（n=3–8），评估Elimusertib单药及各种联合疗法的疗效。联合治疗的剂量和时间表在结果中描述。Elimusertib通过口服灌胃给药，配方为60%聚乙二醇400、30%水和10%乙醇。Elimusertib和Copanlisib由Bayer生产。Niraparib hydrochloride、olaparib、rucaparib、ceralasertib（AZD6738）和berzosertib（VX970）购自Chemietek。Copanlisib配方为0.9% NaCl溶液（pH 7.5），Niraparib配方为5% DMSO和40%聚乙二醇400。联合治疗的细节在结果中分享。

药效学研究

小鼠随机分组（n=4–5）至对照组或治疗组，用Elimusertib 40 mg/kg每天两次治疗3天停4天再治疗3天。治疗第10天，末次给药后4小时采集肿瘤，一部分立即用10%福尔马林固定用于IHC，小部分速冻用于反相蛋白质阵列（RPPA）。

全外显子测序

速冻PDX组织碎片在含蛋白酶K的缓冲液中裂解并匀浆，使用Qiagen DNA Mini Kit提取DNA。正常DNA从全血样本中纯化。全外显子测序（WES）由个体化癌症治疗研究所癌症基因组实验室或Admera Health进行。数据分析包括比对到人类参考基因组hg19，使用BWA、Picard和GATK进行标记重复、重比对和重校准，使用Platypus调用生殖系突变，MuTect调用体细胞突变，Pindel调用indel，DNA拷贝数分析使用内部应用ExomeLyzer和CBS分段。

RPPA

用于药效学分析的PDX肿瘤组织（PDX.003.246、BCX.017、BCX.011和BCX.022）在Elimusertib（20和40 mg/kg）治疗后收集，肿瘤碎片速冻于液氮并储存于-80°C。约3×3 mm大小的肿瘤片置于珠裂解管中进行蛋白质提取，RPPA由MD Anderson功能蛋白质组学核心设施进行。蛋白质定量和标准化加载，使用Limma R包评估差异表达。

IHC

使用4微米厚度的福尔马林固定石蜡包埋PDX组织切片，在Leica Bond RXm自动染色机上进行IHC。切片脱蜡后进行热介导的表位 retrieval，用pH 6.0或pH 9.0的缓冲液，用3%过氧化氢封闭5至30分钟。随后用以下抗体孵育：ATM（克隆Y170，稀释1:250）、p-Chk1（S345，稀释1:50）、p-KAP1（S824，稀释1:200）、H2AX（ser139，克隆20E3，稀释1:300）、cleaved PARP（Asp214，克隆D64E10，稀释1:50）、phospho-S6 ribosomal protein（Ser240/44，稀释1:100）、phospho-mTOR（Ser2448，49F9，稀释1:100）、Ki67（稀释1:100）、cleaved caspase 3（Asp175，稀释1:100）和c-MYc（Y69，即用型）。抗体检测使用Bond polymer Detection kit，以二氨基联苯胺为显色剂，切片用苏木精复染、脱水后封片。染色后的切片在Aperio AT2扫描仪下数字化，由病理学家评估，使用HALO v3.1.1076.449数字图像分析平台进行分析，排除坏死区域，应用病理学家训练的特定算法，基于染色程度和强度获得H-score。

免疫印迹

免疫印迹用于筛选细胞系中c-Myc表达，包括27个乳腺癌细胞系和6个其他癌症或正常细胞系。细胞裂解液中的蛋白质浓度使用Pierce bicinchoninic acid蛋白测定试剂盒测量。蛋白质样品加载到SDS-PAGE凝胶，转移至0.2 μm硝酸纤维素膜，膜用Blocker Casein in PBS封闭1小时，随后用抗c-Myc抗体（1:1000稀释）在5% BSA的TBST缓冲液中室温过夜孵育。洗涤后，用荧光标记的二抗探测，使用Odyssey IR成像系统可视化并定量信号强度。

细胞活力测定

细胞以0.2至2.0×10⁵ cells/100 μL每孔密度接种于96孔板，每组设三个复孔。过夜贴壁后，加入100 μL系列稀释的药物溶液，最终浓度为0.25至25,000 nmol/L。细胞在37°C孵育72小时，随后用50%三氯乙酸固定，0.4% sulforhodamine B溶液染色。OD值在490 nm波长下通过Synergy 4酶标仪读取，IC₅₀使用CalcuSyn软件确定。c-Myc表达水平与Elimusertib IC₅₀的相关性使用GraphPad Prism 10的Pearson相关模型分析。

数据可用性

包含模型的测序数据可在Sequence Read Archive（BioProject ID: PRJNA1251062）获取，本研究产生的其他数据可根据要求从通讯作者处获取。

结果

Elimusertib单药在携带DDR变异PDX模型中的体内疗效

在21个携带DDR通路变异的PDX模型面板中评估了Elimusertib单药疗效。这些PDX代表多种肿瘤组织学类型，包括乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、子宫内膜癌和胆管癌。Elimusertib以两个剂量（20或40 mg/kg，每天两次，用药3天停4天，口服）给药，在敏感模型中显示剂量依赖性抗肿瘤活性。Elimusertib在最大剂量40 mg/kg（每天两次，用药3天停4天，口服）下耐受良好。在21个用40 mg/kg Elimusertib测试的模型中，4个（19%）达到PR，4个（19%）为SD，13个（62%）为PD。总体而言，10个模型显示肿瘤生长抑制，T/C比为0.4或更低。

对Elimusertib响应模型的特征

Figure 1描绘了Elimusertib敏感性、ATM核阳性百分比以及20个有基因组数据的模型中DDR和关键信号分子的选定变异。PDX模型的特征，包括关键基因组变异和治疗历史，列于补充表S1和S2。补充图S4和补充表S3展示了模型中可操作基因的基因组变异。四个对ATR抑制单药40 mg/kg显示部分或完全响应的PDX模型均来源于乳腺肿瘤。一个三阴性乳腺癌（TNBC）模型（BCX.017）通过IHC检测不到ATM表达，但无ATM基因组变异（图2A）。两个乳腺癌模型有BRCA2变异：PDX.003.233有生殖系BRCA2突变，BCX.006有BRCA2缺失（图2B和C）。第四个乳腺癌模型BCX.024无BRCA1/2或ATM DNA变异（图2D）。总体而言，Elimusertib在所有四个模型中显著延长EFS-2。在这个富集DDR变异的PDX系列中，14个乳腺癌模型中的4个（28.6%）对Elimusertib有响应。

ATM缺失通过IHC检测已被探索作为ATRi试验的预测生物标志物，五个模型中发现ATM缺失（<10%核ATM表达）。图2E展示了代表性IHC图像，显示了测试PDX模型中高与低ATM表达的区别。在5个IHC检测ATM缺失的模型中，2个观察到PR/SD。六个PDX模型有ATM功能缺失基因组变异，其中两个ATM IHC阳性<10%；三个模型IHC评分为10%至50%，两个模型IHC阳性>50%。

有趣的是，四个PR模型中的三个有MYC扩增。我们假设MYC扩增可能增加复制应激，从而增加对Elimusertib的敏感性。为追踪这一信号，我们在体外测试了Elimusertib对一组主要乳腺癌（非乳腺癌类型在图中标明）细胞系的疗效，这些细胞系具有不同水平的MYC表达（补充图S5A）。在15个细胞系中，我们比较了MYC表达水平和Elimusertib IC₅₀，未观察到在MYC表达更高的细胞系中有更高的敏感性（补充图S5B和S5C）。进一步分析显示，这些细胞系中MYC水平与对Elimusertib的敏感性无相关性（补充图S5D）。

PDX面板包括三个从预处理肿瘤活检生成的PDX模型，这些患者后来参加了Elimusertib的一期临床试验（NCT03188965）。肿瘤组织学包括结直肠癌和胆管癌（补充图S6A）。PDX.003.074和PDX.003.246有失活ATM突变但无IHC检测的ATM缺失（补充图S6B）。两者都是结直肠癌PDX模型，来源于既往治疗进展的患者。尽管Elimusertib显著延长了EFS-2，但未能稳定PDX.003.246的肿瘤生长，T/C比为0.76。我们还发现，其他靶向DDR通路的疗法面板