食管癌紫杉醇治疗中微管蛋白亚型转换的多组学解析及其在耐药性与间质转化中的 biomarker 价值

本研究通过整合转录组与蛋白质组分析，揭示了食管癌（EC）在紫杉醇治疗后出现微管蛋白亚型转换的现象，特别是神经元特异性β-微管蛋白3（TUBB3）的上调与不良预后相关。研究创新性地发现TUBB3并非直接导致紫杉醇耐药，而是上皮-间质转化（EMT）的标志物。该发现为EC耐药机制提供了新视角，并提示TUBB3可作为治疗抵抗的生物标志物（biomarker），具有重要临床转化潜力。

　　

Highlights

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  治疗抵抗制约食管癌（EC）有效治疗

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  异常微管蛋白表达与其他癌种中紫杉烷类药物耐药相关

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  联合转录组与蛋白质组分析揭示治疗后微管蛋白β3 III类（TUBB3）表达上调

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  实验表明该亚型不直接导致紫杉烷耐药，而是间质转化的标志物

Abstract

Background

尽管采用联合治疗，可切除食管癌（EC）患者的五年生存率仍不足半数。既往研究主要基于转录组学，揭示了这些癌细胞的高度可塑性。在其他癌种中，这种可塑性被证明会导致异常微管蛋白表达和紫杉烷耐药。鉴于紫杉烷类药物是EC治疗的基石，我们建立了对新辅助治疗的EC细胞和组织进行多组学分析的方法，重点关注微管蛋白。

Materials and methods

我们对经预处理的EC切除样本和来自不同治疗环境的原代细胞系应用了转录组学和蛋白质组学技术。将RNA测序和基于质谱（MS）的蛋白质组学数据与临床结局相关联，以识别与治疗反应相关的微管蛋白基因和蛋白质。体外实验包括对候选耐药介导因子进行慢病毒基因沉默和药物干预。

Results

在转录组和蛋白质组数据集中，均发现通常不在食管中表达的微管蛋白亚型与生存结局相关。具体而言，我们发现β-微管蛋白3（TUBB3）与不良预后相关。然而，体外TUBB3沉默并未使细胞对紫杉烷敏感，也未阻止其向耐药细胞状态转变。药物抑制并未提高放化疗疗效。相反，我们发现TUBB3与间质细胞状态高度相关，其表达是此类转变的结果而非原因。

Conclusions

发现一种神经元微管蛋白亚型在经历间质转化并获得耐药性的细胞中增加。这些丰富的蛋白质可作为EC中获得性治疗抵抗的生物标志物。

Introduction

全球范围内，食管癌（EC）具有高发病率和死亡率，且预计在未来十年两者均将上升。自引入多模式治疗策略（如CROSS放化疗方案）以来，中位生存率显著提高。然而，尽管采用这种强化治疗方案，可切除患者的5年生存率仍未超过40%。治疗效果仍然不佳，突显治疗抵抗是EC患者面临的主要问题。因此，迫切需要对治疗抵抗的潜在机制有全面了解。

先前，上皮-间质转化（EMT）已被确定为EC治疗抵抗的主要驱动因素。在EMT过程中，上皮细胞失去细胞间粘附，获得间质形态和增强的运动能力，从而导致治疗抵抗。通过分子谱分析，先前的研究已确定了EC中EMT的几个驱动因素，如TGF-β和IL-6。然而，我们对EMT及可能相关治疗靶点的理解仍不完整，需要进一步研究。

在其他几种癌种中，如乳腺癌、肾细胞癌和口腔癌，定量蛋白质组学已成功用于发现生物标志物、治疗靶点以及参与癌症进展的蛋白质。在食管鳞状细胞癌（ESCC）中，对癌细胞系的蛋白质组分析为了解参与放疗抵抗发展的蛋白质提供了见解。然而，目前缺乏对经过良好注释的食管腺癌（EAC）患者样本进行详尽的蛋白质组分析。在EC这种异质性疾病中理解复杂的肿瘤生物学具有挑战性，其特点是蛋白质通路和基因调控网络的广泛失调。因此，将蛋白质组学等后基因组学技术与RNA测序相结合，可能提供对EC治疗抵抗驱动因素的额外见解，这是单组学分析无法实现的。

紫杉烷类药物是EC全身治疗的基石。这些化合物干扰微管动力学，从而影响癌细胞分裂。在其他癌症背景下，非典型微管蛋白亚型的表达与紫杉烷耐药相关。鉴于先前的转录组分析可能未准确捕捉调控微管蛋白丰度的转录后事件，我们推断在转录组和蛋白质组水平上对其进行分析是研究其在EC紫杉烷耐药中贡献的合适方法。

Materials and methods

Ethical approval and patient characteristics

符合条件的患者年龄≥18岁且经病理证实为食管癌。所有患者均提供了书面知情同意书，允许储存和处理其样本材料。这些材料的生物样本库存储获得阿姆斯特丹UMC医学伦理委员会批准（METC 2013_241）。基线特征见补充表S1。

Cell culture and in vitro treatments

Kyse410、Kyse 520、OE21、Flo1、OE19和OE33细胞（ATCC）在含8%胎牛血清、L-谷氨酰胺（2 mmol/l）、青霉素（100 units/ml）和链霉素（500 μg/ml；均购自Lonza）的RPMI培养基中培养。

卡铂和紫杉醇购自阿姆斯特丹大学医学中心药房。VERU-111购自MedChemExpress。所有细胞系均接受如下为期2周的治疗方案：第1-5天，卡铂（2 μM）和紫杉醇（0.05 nM）或VERU-111（15 nM）联合1 Gy照射；第6-7天，无治疗。该周期从第8天重复至第14天。

Patient biopsy processing

在伦理批准（BiOES; METC 2013_241）下，于2013年至2020年间在阿姆斯特丹UMC医院收集速冻食管肿瘤活检和切除样本。使用冷冻切片机切割20 μm厚的速冻组织切片。收集组织中心5 μm的代表性切片用于后续苏木精-伊红（H&E）染色。肿瘤百分比由经验丰富的病理学家（SLM）确定。在评估的139例食管活检和105例切除样本中，中位肿瘤细胞率分别为45%和35%。使用AllPrep DNA/RNA/miRNA通用试剂盒（Qiagen）按照制造商方案分离总RNA。RNA洗脱于30 μl无RNase水中。使用NanoDrop测量RNA浓度。若RNA浓度>20 ng/μL，则送样进行RNA测序。

RNA sequencing

对重复的细胞系（n = 24）和174个速冻样本进行RNA测序。使用Total RNA library prep RiboErase kit（Roche）进行文库制备。在Illumina HiSeq4000平台上进行测序，生成单端50 bp读长，每个样本1亿条读段。使用FastQC进行测序数据质量评估，确认高质量结果。

使用STAR v2.7.1将RNA-Seq读段映射到人类参考基因组（NCBI37/hg19），并使用Gencode v32注释。仅保留唯一映射的读段。使用DESeq2将得到的基因表达谱转换为DESeq2_vst值，随后进行log₂转换。使用主成分分析（PCA）检查非生物批次效应，并根据需要应用RUVg校正。后续分析在批次校正后的数据集上进行。比对和标准化后，数据进行log₂转换。处理后的数据随后上传至R2: Genomics Analysis and Visualization Platform以供后续分析和可视化。

Proteomics

将29个速冻切除样本送检进行蛋白质组学分析，方法如前所述。简言之，将20 μm的冷冻切片在SDS裂解缓冲液中裂解，将得到的肿瘤裂解液上样于4%-12% NuPAGE SDS-PAGE梯度凝胶（Thermo Fisher Scientific）进行短栈电泳，将蛋白质捕获在一个组分中。通过凝胶内孵育在10 mM二硫苏糖醇/50 mM碳酸氢铵和54 mM碘乙酰胺/50 mM碳酸氢铵中分别进行蛋白质还原和烷基化。通过与测序级修饰胰蛋白酶（Promega）孵育从凝胶中回收肽段。

之后，使用Ultimate 3000 nanoLC系统（Dionex LC-Packings）分离肽段。分离的肽段在+2 kV下电离，并使用Q Exactive质谱仪（Thermo Fisher）进行测量。在Spectronaut version 15.4（Biognosys）中使用SwissProt蛋白质序列数据库（2021年1月下载，42,383个条目）搜索Thermo DIA原始文件。在碎片离子水平导出搜索结果，用于使用R包iq进行MaxLFQ蛋白质定量。数据上传并在R2平台中进行分析。

Quantitative PCR

使用NucleoSpin RNA kit（Bioké, Macherey-Nagel）按照制造商方案分离细胞系RNA。使用Superscript III（Invitrogen）和随机引物（Invitrogen）合成cDNA。在Lightcycler LC480 II（Roche）上使用SYBR green（Roche）进行定量实时PCR。使用比较阈值循环（Cp）法计算相对表达值，并归一化至参考基因hB2M。引物序列见补充表S2。

Flow cytometry

如先前所述进行流式细胞术，使用以下抗体：抗-EpCAM（1:200）、抗-CXCR4（1:200）、抗-N-Cadherin（1:200）、抗-E-Cadherin（1:200）、抗-Beta-III tubulin（1:100）和抗-Beta tubulin（1:100）。使用破膜缓冲液（BD Biosciences）后对细胞内表位进行染色。使用Zombie Red可固定活力染料（1:300）鉴定死细胞并将其排除在分析之外。使用FlowJo 10分析数据。

Proliferation assay

使用IncuCyte S3（Sartorius）或CellTiterBlue（Promega）测定细胞增殖。使用IncuCyte，在处理前、处理期间和处理后获取相位对比图像，并使用汇合度掩膜分析紫杉醇处理和汇合度，所有细胞系和条件下的分割调整设置为1。汇合度在处理前针对接种密度进行归一化。对于细胞活力测定，将细胞接种于96孔板中，并与紫杉醇或VERU-111在37°C下孵育72小时。接着，加入20 μl CellTiterBlue，在37°C避光孵育3小时后，使用荧光酶标仪（Biotek）测量信号。当CellTiterBlue检测显示异常时，使用1%戊二醛和0.5%结晶紫固定细胞。孵育20分钟后，用自来水洗涤细胞。过夜干燥后，将结晶紫染色溶解于1% SDS中，并测量吸光度（600 nm, Biotek）。

Immunohistochemistry

将患者肿瘤材料在4%福尔马林中固定并石蜡包埋，用显微切片机切割4 μm厚的切片。H&E染色由阿姆斯特丹UMC病理科通过常规诊断程序进行。对于TUBB3染色，将切片脱蜡，并在10 mM柠檬酸钠pH 6.0中进行抗原修复，随后使用即用型过氧化物酶封闭液（Dako）在室温下封闭内源性过氧化物酶15分钟。将TUBB3抗体（1:500）在BrightDiluent green抗体稀释液（Immunologic）中稀释，并在4°C湿润 chamber中孵育过夜。第二天，将组织切片与即用型poly-HRP-抗小鼠IgG（Immunologic）在室温下孵育30分钟。使用Bright DAB溶液（Immunologic）根据制造商方案显色。用未稀释的苏木精（Sigma-Aldrich）复染细胞核；切片脱水并封片。

Results

Tubulin isotype protein and transcripts are associated with patient outcome

根据CROSS方案的新辅助放化疗（nCRT）是食管癌的新辅助治疗策略之一。为了研究影响食管癌患者结局的获得性耐药机制，并重点关注微管蛋白，我们对治疗后的切除标本进行了RNA-seq和蛋白质组学分析。从一个更大的治疗后标本队列中，选择了29个同时满足RNA-seq和LC-MS/MS质量要求的样本（补充图S1A，表S1）。在选择高质量样本（定义为蛋白质丰度>3000）后，针对生存、切除后复发和对治疗的组织学反应等患者结局参数进行了差异表达分析。尽管样本内RNA和蛋白质表达相关性较弱，但我们发现微管蛋白超家族中几个成员的上调在蛋白质水平上与较差的患者结局相关（图1A）。

为了进一步评估微管蛋白亚型与患者结局之间的关联，根据检测到的微管蛋白亚型的中位数对RNA-seq和蛋白质组学数据集中的样本进行二分。然后，比较有或无复发患者以及具有低或高Mandard肿瘤消退等级（TRG）评分患者的基因或蛋白质表达。该Mandard评分用于评估对新辅助治疗的组织病理学反应，评分越高表明反应越差。此外，对可用的微管蛋白亚型进行了生存分析。与低表达患者相比，β-微管蛋白3（TUBB3）或γ-微管蛋白1（TUBG1）蛋白高表达患者的总生存期显著缩短（图1B, C, F）。此外，高TUBG1表达的肿瘤具有更高的平均Mandard评分（图1D），并且在随访期间发生复发的患者中TUBG1表达更高（图1E）。在转录水平，较高的α-微管蛋白3E（TUBA3E）水平与较高的Mandard评分、更多复发和随访期间患者死亡相关（图1G-I）。

对健康组织的公共基因表达数据进行分析表明，正常食管组织中最常表达的微管蛋白亚型是TUBA1C、TUBB6和TUBD1（补充图S1B）。我们发现与治疗结局相关的微管蛋白通常不在食管中表达，而似乎特异性表达于神经系统，我们的数据表明，该器官中通常不表达的特定微管蛋白亚型的上调可能参与治疗抵抗。有趣的是，对一部分EC患者的免疫组织化学显示TUBB3的肿瘤特异性定位，且患者间强度各异（补充图S1C）。

Atypical tubulin isotype expression does not confer resistance to taxanes

几种β-微管蛋白亚型的过表达先前已与多种癌种的治疗抵抗相关联。最值得注意的是，TUBB3亚型通过多种提出的机制与紫杉烷耐药相关，并且是癌症患者不良结局的标志物。由于根据CROSS方案治疗的患者接受紫杉醇，并且TUBB3在我们的队列中被发现与不良结局相关，我们假设TUBB3表达可能是EC中对紫杉烷耐药的一种可能机制。为了检验这一假设，通过慢病毒shRNA递送进行TUBB3沉默，随后验证了敲低效率（补充图S2A）。根据细胞系间的敲低效率，选择克隆#205、#206和#207，并评估它们对紫杉醇的敏感性。然而，在这些沉默克隆和乱序对照组之间未观察到紫杉醇敏感性的显著差异（补充图S2B）。

我们接下来考虑到，响应TUBB3沉默，细胞可能上调其他微管蛋白亚型以补偿。使用qRT-PCR评估紫杉醇治疗后微管蛋白亚型的表达，未能在shTUBB3 OE19细胞中揭示其他微管蛋白亚型表达的一致转变（补充图S2C）。然而，我们认为值得注意的是，205克隆和SCR对照在我们研究的各种微管蛋白亚型治疗后表现出相反的表达转变。这可能表明亚型平衡或相互作用在化疗反应中起预测或决定作用。此外，尽管在基线Flo1克隆#207中实现了充分的敲低，但在IC₅₀浓度的紫杉醇治疗后观察到TUBB3的显著上调（补充图S2D）。FACS分析证实，尽管在RNA水平上有效敲低，但TUBB3蛋白表达在治疗后 across conditions 均上调，与敲低无关（补充图S2D）。这种差异可能归因于微管动力学的复杂调控，涉及转录后调控和翻译后修饰。

总的来说，这些结果不支持TUBB3过表达赋予EAC紫杉醇耐药的假设。此外，未观察到向其他与治疗抵抗相关的亚型进行补偿性“亚型转换”。因此，我们得出结论，微管蛋白亚型介导的紫杉烷耐药不太可能解释在患者样本中发现的结果。

TUBB3 is associated with mesenchymal cell states in patient samples and in vitro

接下来，我们试图研究微管蛋白亚型表达与治疗相关细胞表型之间关联的潜在机制。鉴于我们先前的研究显示了上皮-间质转化（EMT）在EAC治疗抵抗中的作用，我们评估了微管蛋白与蛋白质组数据集中EMT蛋白的相关性。TUBB3表现出特别强的关联（图2A）。在EC活检的bulk RNA-Seq数据中，发现TUBB3表达与间质基因波形蛋白（VIM）强烈相关（图2B）。并发现与上皮基因CDH1存在负相关。为了进一步探索这种关联，我们对我们的总细胞系面板进行了RNA-seq分析。通过显微镜评估显示间质表型的细胞系，其TUBB3表达显著高于具有上皮表型的细胞（图2C）。

我们课题组先前的工作表明，放化疗诱导EAC细胞发生EMT，但这种反应的发生具有高度异质性。我们比较了先前建立的EMT发生率和基线微管蛋白表达，并观察到高基线TUBB3表达与更快转变为间质状态之间存在关联（图2D）。TUBB3沉默显示，在大多数克隆中上皮和间质基因均下调（补充图S3）。这些发现共同表明EMT与微管蛋白亚型表达之间存在关联，尤其是在放化疗之后。

Chemo(radio)therapy induces TUBB3 expression

为了通过实验证实上述细胞对放化疗的反应与TUBB3表达之间的关联，使细胞接受先前公布的放化疗方案（图3A）。鉴于新辅助放化疗的反应在EAC中不如ESCC，我们在此将分析重点放在EAC上。通过qRT-PCR量化治疗前后的TUBB3表达，揭示放化疗后TUBB3表达显著增加（图3B）。FACS分析进一步证实了这一观察结果，尽管在蛋白质水平上的反应更为异质（图3C）。

接下来，我们旨在通过评估放疗和化疗的单独效应，确定放化疗方案中哪个组分负责诱导TUBB3蛋白表达。这表明单独放疗不诱导TUBB3表达，而化疗确实导致TUBB3水平增加（图3C）。这与我们先前的发现一致，即放疗诱导代谢重编程，而化疗诱导间质转化。对卡铂和紫杉醇（CROSS方案中化疗骨架的单独组分）的进一步研究表明，两种药物都能够诱导TUBB3表达（图3D, E）。这些发现与先前描述卡铂和紫杉醇均能上调TUBB3的报告一致，并进一步支持微管蛋白亚型表达通过EMT介导的治疗抵抗与患者结局相关的假设。

Selective TUBB3 inhibition is cytotoxic but does not prevent epithelial-to-mesenchymal transition

接下来，我们旨在阐明TUBB3表达是否影响EAC中的EMT。考虑到我们先前发现细胞系能够在RNA水平充分敲低的情况下仍上调TUBB3，我们选择了药物抑制。药物抑制将提供直接的转化相关性，并通过诱导急性而非长期抑制来规避潜在的细胞适应性。虽然目前有许多靶向微管蛋白的药物可用，如紫杉烷，但很少有亚型特异性抑制剂存在。VERU-111被提出作为TUBB3和TUBB4的相对选择性抑制剂。进行细胞活力测定以评估各种细胞系对VERU-111治疗的反应并确定IC₂₀（图4A）。鉴于VERU-111和紫杉醇都靶向微管蛋白，进行了协同性测定以评估这些化合物之间的潜在相互作用。发现该组合在所测试的细胞系中具有拮抗作用（图4B），可能是由于竞争性拮抗。基于这些发现，我们选择在后续的放化疗实验中用IC₂₀剂量的VERU-111替代紫杉醇，并将结果与标准的卡铂和紫杉醇方案进行比较。

通过FACS评估治疗对TUBB3表达的影响在细胞系间是异质的，但VERU-111在OE19细胞中阻止了放化疗诱导的TUBB3上调（图4C）。最后，我们通过使用FACS测量治疗前后的细胞状态标志物来评估VERU-111对EMT的反应。为此，我们使用了上皮标志物E-钙粘蛋白（CDH1）和上皮细胞粘附分子（EpCAM），以及间质标志物N-钙粘蛋白（CDH2）和C-X-C趋化因子受体4型（CXCR4）。值得注意的是，与紫杉醇相比，VERU-111导致间质标志物的更大程度上调，但也增加了E-钙粘蛋白的表达（图4D）。我们认为这些结果意味着，虽然TUBB3表达与EMT相关，但缺乏因果关系的证据。因此，发现的微管蛋白亚型表达与治疗抵抗之间的关联可能是治疗诱导的EMT的结果，而不是驱动因素，并且可能是这种抵抗机制发生的生物标志物。

Discussion

治疗抵抗是治疗食管癌的主要挑战之一，高肿瘤复发风险及随之而来的较差生存率突显了这一点，尤其是在对新辅助治疗反应不完全的患者中。在EAC中，治疗诱导的EMT已被确定为治疗抵抗的主要驱动因素。迄今为止，我们对EAC中EMT的理解大部分来源于基于RNA的研究。由于转录后和翻译后调控在控制功能表型中的重要作用，结合蛋白质组学和基因组学可能有助于发现新的生物标志物或治疗靶点。在本研究中，我们使用蛋白质基因组学方法，将微管蛋白亚型TUBB3、TUBG1和TUBA3E确定为EAC患者结局的生物标志物。

微管蛋白亚型表达先前已与患者结局和治疗抵抗相关。最值得注意的是，TUBB3过