靶向PDIA3抑制乳腺癌细胞粘附与代谢重编程：C-3399的新型抗转移机制研究

本研究针对乳腺癌转移过程中癌细胞与内皮细胞粘附这一关键环节，探讨了PDIA3抑制剂C-3399通过调控细胞能量代谢（如抑制TCA循环代谢物和增强乳酸生成）显著抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞粘附的机制，为靶向PDIA3的抗转移治疗提供了新策略。

　　

乳腺癌转移是导致患者死亡的主要原因，而癌细胞与血管内皮细胞的粘附是转移过程中的关键步骤。近年来，研究发现蛋白二硫键异构酶（Protein Disulfide Isomerase, PDI）家族成员在癌症进展中扮演重要角色，尤其是PDIA3（也称为ERp57）的表达上调与乳腺癌细胞侵袭性增强密切相关。然而，PDIA3是否通过调节癌细胞代谢来影响其粘附行为尚不清楚。此外，尽管靶向癌细胞代谢已成为治疗策略之一，但针对PDIA3调控代谢与粘附交叉点的研究仍较少。因此，深入研究PDIA3在乳腺癌细胞粘附及代谢中的作用机制，对于开发新型抗转移治疗具有重要意义。

在这项发表于《Biochemical Pharmacology》的研究中，研究人员使用一种新型PDIA3抑制剂C-3399（一种芳香族N-磺酰胺衍生的氮丙啶-2-羧酸化合物），探讨了抑制PDIA3对乳腺癌细胞粘附行为及细胞能量代谢的影响。研究团队通过细胞培养、基因沉默（shRNA敲低PDIA1和PDIA3）、实时荧光定量PCR、Western blot、细胞毒性检测（MTS法）、细胞粘附实验（使用胶原蛋白I和纤连蛋白作为基质，以及人肺微血管内皮细胞hLMVEC）、液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）分析药物代谢和细胞代谢物、Seahorse细胞能量代谢分析（测量线粒体呼吸和糖酵解）以及代谢组学分析等技术手段，系统评估了C-3399对两种乳腺癌细胞系（MCF-7，代表luminal亚型；MDA-MB-231，代表basal亚型）的效应。

研究结果显示，首先，通过shRNA成功构建了PDIA1和/或PDIA3沉默的MCF-7细胞系，证实了基因沉默的效率（Fig. 1）。随后，细胞毒性实验表明C-3399在浓度≤30 μM时对细胞活力影响较小，因此后续功能实验选用1-50 μM浓度范围（Fig. 2）。粘附实验发现，C-3399以浓度依赖性方式抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞对hLMVEC、胶原蛋白I和纤连蛋白的粘附，且在MCF-7细胞中效果更显著（Fig. 3A-B）。值得注意的是，在PDIA3沉默的细胞中，C-3399的抗粘附作用消失，而在PDIA1沉默细胞中仍存在，表明C-3399的作用主要通过抑制PDIA3介导（Fig. 3C-D）。此外，当仅在癌细胞中抑制PDIA3时，粘附显著降低；而仅在内皮细胞中抑制时，粘附反而增加，提示PDIA3在癌细胞中的作用更为关键（Fig. 3E-F）。

药物代谢分析显示，C-3399主要存在于培养基中，而其代谢产物C-3399-B则在细胞 pellet 和培养基中均被检测到，表明C-3399可能在细胞外水解，其抗粘附作用主要源于对细胞外PDIA3的抑制（Fig. 4）。能量代谢分析（Seahorse assay）揭示，C-3399处理30分钟后，MCF-7细胞的线粒体呼吸参数（如ATP生产、最大呼吸能力和备用呼吸能力）下降，质子漏增加，糖酵解（ECAR）也被抑制；而在MDA-MB-231细胞中这些效应较弱（Fig. 5）。使用经典代谢抑制剂（如寡霉素、鱼藤酮、抗霉素A和2-脱氧葡萄糖）进一步证实，抑制线粒体呼吸和糖酵解可模拟C-3399的抗粘附效果，尤其在MCF-7细胞中效果更明显（Fig. 6）。

代谢组学分析（LC-MS/MS）发现，MCF-7细胞基线水平具有较高的TCA循环代谢物（如苹果酸、富马酸盐、α-酮戊二酸和异柠檬酸盐），而C-3399处理下调了这些代谢物，并增加了乳酸生成，提示代谢向糖酵解偏移。相反，在MDA-MB-231细胞中，C-3399对TCA代谢物影响不显著，但抑制了糖酵解和磷酸戊糖途径（PPP）的一些中间产物（Fig. 7）。这些代谢差异与两种细胞系的固有代谢表型一致：MCF-7更依赖氧化磷酸化（OXPHOS），而MDA-MB-231更具糖酵解性。最后，研究排除了C-3399通过影响内皮细胞ICAM-1表达介导抗粘附的可能性，因为C-3399处理并未改变hIL-1β诱导的ICAM-1表达（Fig. 9）。

综上所述，本研究首次证实PDIA3抑制剂C-3399通过靶向细胞外PDIA3，抑制整合素介导的粘附信号，进而下调线粒体能量代谢（特别是TCA循环），最终减少乳腺癌细胞与内皮细胞及细胞外基质的粘附。这种抗粘附效应在代谢表型更依赖OXPHOS的MCF-7细胞中更为显著。研究强调了靶向细胞外PDIA3作为抑制乳腺癌转移的新策略，并通过调控癌细胞代谢与粘附的交叉对话，为开发选择性PDI抑制剂提供了重要依据。此外，C-3399的效应似乎不可逆，且其主要作用于细胞外领域，减少了潜在细胞内毒性风险，因此具有较好的转化应用前景。未来研究可进一步探索PDIA3与整合素（如β3亚基）的直接相互作用，以及其在其他癌症类型中的普遍性。