综述：靶向病毒糖蛋白预融合状态的精准疫苗设计：结构疫苗学进展

本综述系统阐述了结构疫苗学在精准设计靶向病毒糖蛋白预融合状态疫苗的最新进展。文章重点解析了通过 cavity-filling mutations、proline substitutions、disulfide bond engineering 等策略增强蛋白稳定性、溶解性及免疫原性的分子机理，并总结了其在 RSV、HIV、SARS-CoV-2 等重要病毒疫苗研发中的成功应用，为应对新发病毒威胁提供了扎实的理论与技术框架。

　　

病毒糖蛋白的预融合构象是疫苗设计的关键靶点，因其能够诱导强效的中和抗体反应。然而，这一构象常处于亚稳态，易发生构象重排，转变为免疫原性较弱的融合后状态，从而削弱疫苗的保护效果。随着结构生物学与计算生物学的发展，结构疫苗学为精准设计并稳定病毒蛋白的预融合构象提供了强大工具。

Cavity filling mutations to stabilize viral glycoproteins in prefusion state

cavity-filling mutations（空腔填充突变）是一种通过理性设计提升蛋白稳定性的核心策略。其原理是将蛋白质内部空腔中的小侧链氨基酸（如丙氨酸、甘氨酸）替换为具有更大侧链的氨基酸（如缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸），从而增强蛋白质内核的紧密堆积，减少局部柔性，有效抑制非预期的构象变化。这类突变通过降低蛋白熵值、增强范德华力相互作用，显著提高了预融合构象的热力学稳定性。

Proline substitutions for structural rigidity

脯氨酸由于其独特的环状结构和固定的二面角，在引入蛋白质的柔性环区或铰链区时，能够有效地限制局部构象的移动性，从而稳定α-螺旋并阻止向融合后状态的转变。在多个病毒融合蛋白（如SARS-CoV-2 Spike蛋白）的S2亚基中，引入脯氨酸替代（例如2P或6P突变）已被证明是锁定预融合状态的经典且高效的方法。

Disulfide bond engineering for conformational locking

二硫键工程是通过在蛋白质三维结构中战略位点引入一对半胱氨酸，从而形成共价的二硫键（Disulfide Bond），将不同的结构域或链“钉锁”在一起。这种共价交联极大地降低了发生大规模构象重排的可能性，增强了蛋白质的整体刚性，并常常带来熔解温度（Tm值）的显著提升，是提高疫苗抗原热稳定性的关键技术。

Enhancing solubility and reducing aggregation

病毒糖蛋白表面暴露的疏水残基是导致其表达困难、易于聚集和免疫原性降低的主要原因。通过蛋白质工程，将这些疏水残基替换为极性或带电荷的亲水残基，可以大幅改善蛋白质的溶解性，减少寡聚化或形成不可溶包涵体的倾向，从而获得高产、高纯度的可溶性抗原，这对于疫苗的大规模生产至关重要。

Stabilization through salt bridges and charge balancing

盐桥（Salt Bridge）是带相反电荷的氨基酸侧链之间形成的静电相互作用，能够稳定蛋白质的特定构象。通过工程化改造，在域间界面或柔性环区引入或优化盐桥网络，可以增强预融合状态的稳定性。此外，电荷平衡突变通过缓解蛋白质内部或表面的过度静电排斥，进一步优化了蛋白质的静电势能面，有助于维持其天然折叠状态。

Removal of proteolytic cleavage sites

许多病毒糖蛋白需要被宿主蛋白酶（如弗林蛋白酶Furin、TMPRSS2等）在特定位点（如S1/S2或S2′）切割后才能完全激活并引发膜融合。通过突变去除这些蛋白酶切割位点，可以阻止蛋白的过早激活，使其稳定在预融合的“未触发”状态，这是设计安全有效疫苗的关键一步。

Hydrophobic core optimization and fusion peptide modifications

优化蛋白质的疏水内核，通过引入更大的疏水残基来填充内部空腔，可以增强范德华力相互作用，使蛋白质核心更加致密和稳定，从而提高其对热或化学变性的抵抗力。同时，对高度保守的融合肽（Fusion Peptide）区域进行修饰或掩蔽，可以防止其过早插入宿主细胞膜，从源头上避免构象变化的触发。

Glycan shielding for immune focusing

聚糖屏蔽（Glycan Shielding）是通过添加或重新定位N-糖基化位点，在蛋白质表面覆盖一层糖链。这些糖链可以有效地物理遮蔽非中和抗体表位或免疫显性但非保护性的可变区，从而将免疫系统的攻击焦点“引导”至保守的、具有强保护效力的关键中和表位（如受体结合域RBD），实现免疫聚焦，诱导出更优的抗体反应谱。

综上所述，通过cavity-filling mutations、proline substitutions、disulfide bond engineering、charge balancing、glycan shielding等一系列基于结构的精准设计策略，研究人员已经能够成功地构建出一系列预融合稳定的病毒糖蛋白免疫原。这些免疫原在结构稳定性、表达水平、免疫原性和保护效力方面都展现出巨大优势，并已成功应用于针对RSV、HIV和SARS-CoV-2等重大病原体的新一代疫苗研发中，为未来快速应对新发传染病威胁奠定了坚实的技术基础。