人羊膜间充质干细胞外泌体通过抑制JNK/MAPK介导的EGR1表达抑制脑出血后铁死亡

本刊推荐：为探索脑出血(ICH)后神经功能缺损的治疗新策略，研究人员开展了人羊膜间充质干细胞外泌体(hAMSC-Exos)调控铁死亡(ferroptosis)的机制研究。研究发现hAMSC-Exos通过抑制JNK/MAPK信号通路下调EGR1表达，显著改善ICH模型神经功能恢复，降低炎症和铁死亡水平。该研究为ICH治疗提供了新的细胞治疗思路和精准靶点。

　　

自发性脑出血（ICH）是卒中领域的重要组成，其特点是起病急骤、症状进展迅速，造成的神经功能损伤往往不可逆转。流行病学研究显示，脑出血的30天死亡率高达30%，90天内更可升至40%-50%，给社会和家庭带来沉重负担。然而，当前的治疗手段主要以手术缓解症状为主，不仅伴随严重副作用，对深部血肿或脑室出血效果有限。近年来，铁死亡（ferroptosis）作为一种新型细胞死亡方式备受关注，其特点是依赖铁的细胞内脂质过氧化物积累。由于神经系统富含铁离子且对缺氧损伤敏感，加上脑出血后血肿分解会释放大量血红蛋白和铁离子，铁死亡被认为是神经细胞死亡的重要模式。在这一背景下，干细胞疗法为神经功能恢复带来了新希望，其中人羊膜间充质干细胞（hAMSC）因其低免疫原性、低致瘤风险和易获取等优势备受青睐。然而，干细胞治疗仍存在细胞栓塞风险和伦理限制。而hAMSC来源的外泌体（hAMSC-Exos）不仅能保留干细胞的治疗益处，还能规避这些风险，成为极具前景的治疗剂。

为探索hAMSC-Exos在脑出血治疗中的潜力，研究团队在《Brain Organoid and Systems Neuroscience Journal》上发表了最新研究成果。研究人员通过超速离心法成功提取并表征了hAMSC-Exos，随后在胶原酶VII诱导的ICH大鼠模型和血红素（hemin）诱导的PC12细胞模型中评估了hAMSC-Exos的治疗效果。研究采用转录组测序技术筛选关键基因和通路，并通过蛋白质印迹（Western blot）、免疫荧光、ELISA等技术进行了验证。研究还通过过表达质粒转染和通路激活剂处理进行了挽救实验。

研究首先成功分离并表征了hAMSC和hAMSC-Exos。流式细胞术显示hAMSC高表达CD44、CD73、CD90和CD105等间充质干细胞表面标志物。透射电镜显示外泌体呈典型杯状结构，纳米颗粒跟踪分析显示粒径主要分布在30-150nm范围内，zeta电位约为-30mV，蛋白质印迹证实外泌体表达CD9、TSG101、CD81而不表达Calnexin。体内外实验表明外泌体具有良好的脑靶向性和细胞摄取效率。

在功能实验中，hAMSC-Exos治疗显著改善了ICH大鼠的神经功能恢复。改良神经严重程度评分（mNSS）和Bederson评分显示，治疗组在14天时神经功能明显改善（p<0.001）。HE染色显示治疗组血肿范围减小，吸收加快。TUNEL染色和免疫组化显示，治疗组凋亡细胞减少，Caspase 3和TNF-α表达降低。ELISA检测发现炎症因子IL-1β和IL-6水平也显著降低。

在铁死亡相关评估中，蛋白质印迹显示ICH组xCT和GPX4表达降低而ACSL4表达升高，hAMSC-Exos治疗逆转了这些变化。免疫荧光染色进一步证实了GPX4和ACSL4的表达变化。此外，治疗组Fe²⁺和MDA水平降低，表明铁死亡和氧化应激水平得到缓解。

在PC12细胞模型中，CCK-8和LDH实验确定了40μM hemin诱导24小时为最佳建模条件，20μg/mL hAMSC-Exos处理48小时为最佳治疗条件。划痕实验显示hAMSC-Exos促进了细胞迁移能力。透射电镜显示治疗组线粒体形态改善，ROS和Fe²⁺水平降低，线粒体膜电位恢复，MDA水平降低而SOD和GSH水平升高。

转录组测序筛选出342个差异表达基因（DEGs），GO分析显示这些基因主要富集在炎症反应等生物过程，KEGG分析显示MAPK通路排名第一。铁死亡相关DEGs分析筛选出前10个枢纽基因，包括Egr1、Nos2、Nr4a1等。qRT-PCR验证显示Egr1在ICH组显著升高而在治疗组降低。蛋白质印迹证实ICH组EGR1表达和p-JNK/JNK比值升高，hAMSC-Exos治疗抑制了这些变化。免疫荧光显示治疗组EGR1荧光强度降低。

挽救实验显示，EGR1过表达质粒转染和JNK激活剂Anisomycin处理均逆转了hAMSC-Exos对铁死亡标志物（xCT、GPX4、ACSL4）的调控作用。此外，Anisomycin处理还逆转了hAMSC-Exos对EGR1和p-JNK/JNK的抑制作用，表明JNK可能通过调控EGR1影响铁死亡。

安全性评估显示，hAMSC-Exos治疗未引起心、肝、脾、肺、肾的显著组织病理学改变，血常规和血清生化分析也未发现显著异常，表明hAMSC-Exos具有良好的生物安全性。

研究结论表明，hAMSC-Exos通过抑制JNK/MAPK信号通路下调EGR1表达，减轻脑出血后的铁死亡、炎症和凋亡水平，促进神经功能恢复。这一发现不仅为脑出血治疗提供了新的细胞治疗策略，还揭示了JNK/MAPK-EGR1信号轴在铁死亡调控中的关键作用，为精准治疗提供了潜在靶点。

研究的创新性在于首次系统阐述了hAMSC-Exos在脑出血中铁死亡调控的作用机制，并明确了EGR1作为关键靶点的重要性。同时，研究通过多模型、多技术平台的综合验证，为临床转化提供了坚实理论基础。未来研究可进一步探索外泌体的最佳给药方案、长期疗效以及在其他神经系统疾病中的应用潜力。