β-葡聚糖体外诱导鲁氏鲮头肾巨噬细胞样细胞训练免疫的代谢与表观遗传机制研究

本研究针对水产养殖中鲁氏鲮（Labeo rohita）疾病频发且缺乏广谱免疫保护策略的问题，通过体外β-1,3-glucan刺激头肾巨噬细胞样细胞，系统评估了训练免疫（trained immunity）的诱导效应。研究发现再刺激后细胞糖酵解水平显著增强（LDH、lactate↑，glucose↓），关键基因（mtor、hif1α、hdac12）及促炎因子（tnfα、il6、ifnγ）表达上调，证实了β-glucan可通过代谢重编程和表观遗传修饰激活鱼类先天免疫记忆，为水产疫病防控提供了新思路。

　　

在水产养殖业蓬勃发展的今天，疾病暴发始终是制约产业可持续健康发展的关键瓶颈。特别是以鲁氏鲮（Labeo rohita）为代表的印度主要鲤科鱼类，因其经济价值高、养殖范围广，在东南亚市场占有重要地位。然而，频繁发生的细菌感染——如 Aeromonas spp.、Edwardsiella tarda 和 Acinetobacter pittii 等——常常导致大规模死亡和经济损失。传统疫苗虽有效，但通常只针对特定病原，且研发成本高、覆盖面有限，无法应对复杂多变的水产病害环境。因此，开发能够提供广泛、非特异性保护的免疫策略成为当前研究的焦点。

在此背景下，“训练免疫”（trained immunity）作为一种新兴的免疫机制引起了学者们的高度关注。它指的是先天免疫细胞（如巨噬细胞）在初次接触某种刺激物（如β-葡聚糖）后，通过代谢与表观遗传层面的重编程，获得对后续感染更强、更快速的应答能力，甚至能够跨病原提供保护。这种现象在哺乳动物和部分硬骨鱼中已有报道，然而在鲁氏鲮中相关机制仍属未知。

为此，研究人员在《Comparative Immunology Reports》上发表了一项开创性研究，旨在探讨β-1,3-glucan能否在鲁氏鲮头肾来源的巨噬细胞样细胞中诱导训练免疫，并分析其潜在的代谢和分子机制。

该研究首先从健康鲁氏鲮的头肾中分离出巨噬细胞样细胞，使用Histopaque-1077进行梯度离心获取单核细胞，经L-15培养基培养并纯化贴壁细胞。实验设计包括三组：对照组（T1，仅DMSO处理）、刺激组（T2，单次50 μg/ml β-1,3-glucan处理）和再刺激组（T3，间隔7天两次同剂量处理）。细胞在不同时间点（1–72小时）收取样本，从代谢活性和基因表达两大方面展开系统评估。

关键技术方法包括：

通过Resazurin还原法检测细胞代谢活性；使用商用试剂盒测定培养上清中乳酸（lactate）、乳酸脱氢酶（LDH）活性和葡萄糖（glucose）消耗；通过实时荧光定量PCR（qPCR）分析训练免疫关键标记基因（包括mTOR、HIF1α、HDAC12）和细胞因子（TNFα、IL6、IFNγ）的mRNA表达变化，以β-actin作为内参，采用2^(-ΔΔCt)法进行相对定量；数据经GraphPad Prism 9软件进行统计分析，包括单因素及重复测量方差分析（ANOVA），辅以Tukey事后检验。

研究结果

细胞代谢活性评估（Resazurin还原实验）

再刺激组（T3）在所有时间点均显示出最低的吸光度值，表明其细胞代谢活性最高，resazurin被大量还原为resorufin。与T1和T2组相比，T3自3小时起就呈现极显著差异（p<0.0001），说明β-glucan再刺激显著增强了细胞的代谢功能。

体外细胞代谢活性趋势

LDH活性与乳酸产量在T3组随时间推移持续上升，至72小时达到峰值，显著高于对照组和单次刺激组。与此同时，葡萄糖消耗在T3组中也最为明显，特别是在48小时和72小时，与T1组相比有显著下降（p<0.01）。这些结果一致表明，经过β-glucan再刺激的细胞发生了明显的糖酵解代谢重编程，即Warburg效应，这是训练免疫的典型代谢特征。

细胞因子tnfα、il6和ifnγ的mRNA转录分析

促炎细胞因子基因表达在再刺激组中普遍上调。

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  TNFα: T3组表达量最高，在3小时和24小时与T1、T2组有显著差异（p<0.05）。

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  IL6: T3组在多数时间点表达显著高于T2，例如在12小时差异极显著（p<0.001）。

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  IFNγ: 在T3组6小时和24小时表达升高，但48小时后各组无显著差异。

  结果表明，再刺激显著强化了巨噬细胞的炎症应答能力。

mTOR、HIF1α和HDAC12的表达

关键训练免疫相关标记基因在T3组表达显著增强：

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  mTOR: T3组在6小时后果断上升，24小时达到峰值，表达量显著高于T2（p<0.01）。

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  HIF1α: T3组在所有时间点表达均高于T2，尤其在24小时差异明显。

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  HDAC12（组蛋白去乙酰化酶）: 作为表观遗传修饰标志，在T3组同样呈现时间依赖性上调，24小时表达最高。

  这些结果从分子水平证实β-glucan再刺激通过激活mTOR-HIF1α信号轴和表观遗传调控机制诱导了训练免疫。

讨论与结论

本研究通过多维度实验数据证实，β-1,3-glucan再刺激能够成功诱导鲁氏鲮头肾巨噬细胞样细胞的训练免疫状态。该状态表现为代谢途径向糖酵解倾斜（乳酸产量增加、葡萄糖消耗加剧），以及关键基因（mTOR、HIF1α、HDAC12）和细胞因子（TNFα、IL6、IFNγ）的表达上调。尤其是HDAC12的上调，暗示β-glucan可能通过组蛋白修饰等表观遗传机制重塑染色质结构，使相关免疫基因在二次刺激时更易被激活，从而促成长效的免疫记忆。

该发现不仅与哺乳动物及其他鱼类（如斑马鱼、鲤鱼、河豚）中训练免疫的研究结果一致，还首次在鲁氏鲮中系统验证了β-glucan的免疫训练功能，填补了该物种在先天免疫记忆研究领域的空白。从应用角度看，β-glucan作为一种天然多糖，易获取、成本低、安全性高，极有潜力成为替代传统疫苗的免疫增强剂，用于水产养殖中的广泛病害防治，减少抗生素使用，促进绿色渔业发展。

当然，本研究仍存在一定局限性，例如未能涉及体内感染模型、未考察训练免疫的长期效应及其对特定病原的实际防控效率。今后研究可进一步优化β-glucan的给药剂量与程序，探索其在完整鱼体中的免疫保护效果，并深入揭示其表观遗传调控的具体靶点与信号网络。总之，这项工作为鱼类训练免疫机制提供了扎实的实验证据，也为开发新型鱼用免疫制剂奠定了理论基础。