卵泡液来源小细胞外囊泡在个体化体外成熟中的应用显著提升囊胚发育质量

本研究发现，在个体化体外培养体系中，添加低剂量（6.5 μg/mL）的卵泡液来源小细胞外囊泡（FF-sEVs）可显著提高牛囊胚发育率、增加总细胞数（TCN）和内细胞团（ICM）数量，并降低凋亡比率（ACR）。该研究为优化辅助生殖技术（ART）提供了新策略，凸显了FF-sEVs在胚胎体外生产（IVP）中的重要作用。

　　

引言

在辅助生殖技术（ART）中，胚胎的生产和质量是提高妊娠成功率的关键因素。随着研究人员和临床医生探索创新策略以增强体外胚胎生产（IVP），细胞外囊泡（EVs）已成为生殖生物学中的关键角色。细胞外囊泡是一组多样的膜结合颗粒，包括外泌体、微囊泡、凋亡小体和ectosomes，它们在大小、起源和表面标记物上有所不同。几乎存在于所有生物体液中，EVs携带生物活性分子（例如蛋白质、脂质和核酸）的货物，这些分子被递送到受体细胞，影响细胞功能。这些特性使EVs成为关键生殖过程的重要调节因子。

富含蛋白质、脂质、核酸和激素的卵泡环境在支持卵母细胞成熟中起着至关重要的作用。此外，卵泡液（FF）已被确定为EVs的重要来源。这些FF-EVs被认为通过将生物活性分子转移到靶细胞来介导卵母细胞成熟和早期胚胎发育。然而，它们的效果可能因卵泡生长阶段而异。例如，虽然来自排卵前FF的EVs显示出一些积极效果，但来自小卵泡的EVs似乎比来自较大卵泡的EVs更有效地增强卵丘细胞扩张和胚胎发育。这表明EVs的功能特性受卵泡发育阶段的影响，突出了需要进一步研究以优化它们在ART中的使用。

体外补充FF来源的小EVs（sEVs）已被证明促进卵丘卵母细胞复合体（COCs）中的众多事件，然而这些发现基于群体培养生产系统。在群体培养中，卵母细胞成熟、受精和胚胎发育与至少25个卵母细胞或胚胎一起进行，通常密度为每2μL培养液1个受精卵。在无血清条件下，该方法在受精后第8天产生高达40–50%的囊胚率。相比之下，个体培养的胚胎，即使在1:20的密度下（最小液滴体积为20μL），显示出降低的囊胚率（30–40%）和更大的变异性，当成熟和受精也单独进行时，有时降至30%以下。个体培养的囊胚还表现出较低的孵化率、减少的总细胞数和更高的凋亡细胞比率，与群体培养的胚胎相比。这些差异归因于个体培养系统中缺乏来自邻近卵母细胞或胚胎的自分泌和旁分泌信号。尽管存在这些挑战，开发可靠的单个卵母细胞培养系统是必要的，因为它能够个体监测胚胎活力和质量，这对于优化ART结果至关重要。

迄今为止，尚无研究调查在完全个体培养系统中向成熟培养基中添加FF-sEVs的效果。此外，在群体培养条件下完全无血清IVP过程中FF-sEVs补充的剂量特异性影响仍不清楚。我们假设在体外成熟（IVM）培养基中添加FF-sEVs可以改善群体和个体培养系统中的胚胎发育和质量。本研究的目的是评估在无血清条件下群体和个体培养中补充不同浓度的FF-sEVs的效果，以评估它们对后续胚胎发育和质量的影响。

材料和方法

培养基和试剂

组织培养培养基（TCM）-199、庆大霉素和磷酸盐缓冲盐水（PBS）购自Life Technologies Europe（比利时根特）。除非另有说明，所有其他化学品均购自Sigma-Aldrich（比利时奥弗莱斯）。在使用前，所有培养基均使用0.22μm过滤器（GE Healthcare-Whatman，比利时迪根）过滤。

遵守MISEV2023指南

卵泡液-sEVs的收集、预处理、储存、分离、表征、内化测定和功能分析均按照细胞外囊泡研究最小信息2023指南进行。

卵泡液收集

所有动物程序均经安特卫普大学动物测试伦理委员会（比利时安特卫普）和佛兰芒政府（ECD档案2019–44）批准。从单一牛群中选择四头健康的荷斯坦小母牛（12–14个月大），通过直肠超声检查确认周期性，基于黄体的存在。为了同步发情以进行FF收集，实施了双重Ovsynch协议：小母牛在第-26天接受0.02mg GnRH（Receptal?，MSD Animal Health），在第-19天接受500μg氯前列醇（Estrumate?，MSD Animal Health），并在第-17天接受第二次GnRH剂量。该协议在7天后重复（第-10天GnRH，第-3天氯前列醇，第-1天GnRH），排卵指定为第0天。

在排卵后第4.5天，通过经阴道超声检查抽吸第一卵泡波的优势卵泡（约8mm直径）。简要地说，小母牛被 restraint，会阴用碘皂、乙醇（70%）清洁并干燥。硬膜外麻醉（2mL 4% Procain HCl，VMD，比利时）后，7.5-MHz超声 transducer（Pie Medical Imaging，荷兰）引导卵泡穿刺。使用5mL注射器通过不锈钢和硅胶线抽吸卵泡液。无血的FF样品转移到微量离心管中，在1小时内4°C运输，离心（10,000×g，10分钟，4°C），过滤（0.22μm，GE Healthcare-Whatman，比利时），并储存在-80°C。

小细胞外囊泡的分离和表征

使用OptiPrep?密度梯度超速离心（ODG UC）协议从FF中分离小EVs，该协议 adapted from Van Deun et al. 和 by Asaadi et al. 用于牛FF样品。简要地说，碘克沙醇梯度（5、10、20和40%）通过混合OptiPrep?（60% w/v 碘克沙醇）与匀浆缓冲液（10mM Tris–HCl，1mM EDTA，0.25M蔗糖，pH 7.4）制备。梯度在16.8mL polyallomer管（Beckman Coulter，Brea，CA，USA）中分层如下：4mL 40%，4mL 20%，4mL 10%，和3.5mL 5%碘克沙醇溶液。将1mL FF覆盖在梯度上，并在100,000×g下离心18小时，4°C（SW 32.1 Ti转子，Beckman Coulter）。从小EVs从16个梯度层的8–10部分收集，合并，用13mL PBS稀释，并离心（100,000×g，3小时，4°C）。沉淀重悬于100μL PBS中，并储存在-80°C用于下游分析。

小EVs表征包括透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和Western blotting，遵循先前出版物建立的验证协议。对于TEM，解冻的FF-sEVs吸附在Formvar/碳包被的铜网格（Aurion，莱顿，荷兰）上，用1%乙酸铀酰染色，并使用JEM 1400 Plus显微镜（JEOL，比荷卢经济联盟）成像。纳米颗粒跟踪分析使用NanoSight LM10（Malvern Instruments，UK）进行：FF-sEVs在PBS中稀释（3×10⁸–1×10⁹颗粒/mL），注入 chamber，并用NTA Software 3.2分析（每个样品三个60秒视频；检测阈值3，相机水平13）。对于Western blotting，FF-sEVs裂解物在还原缓冲液（0.005%溴酚蓝，3% 2-巯基乙醇，9.2% SDS，40%甘油，0.5M Tris–HCl，pH 6.8）中95°C变性5分钟，通过SDS-PAGE分离，并转移到硝酸纤维素膜（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。膜用5%牛血清白蛋白（BSA）/0.5% Tween-20封闭，在4°C overnight与一抗 against CD63（Abcam ab68418，1:250）、TSG101（Santa Cruz sc-7964，1:1000）和CD9（CST-D3H4P，1:1000）孵育，用0.5% Tween-20/PBS洗涤，AGO-2（Abcam ab32381，1:1000），并与HRP结合的抗小鼠（1:3000）或抗兔（1:4000）IgG二抗（GE Healthcare）孵育。化学发光（Western Bright Sirius，Advansta）使用Proxima 2,850成像仪（IsoGen Life Sciences，荷兰）检测。

评估体外成熟期间小细胞外囊泡的摄取

使用ExoGlow-Protein EV标记试剂盒（System Biosciences，Palo Alto，CA）根据制造商的说明标记卵泡液-sEVs，并如先前在马物种中描述的FF-sEVs。简要地说，FF-sEVs与1:500稀释的500X荧光标记染料在PBS中孵育20分钟，37°C，温和振荡。通过添加ExoQuick-TC溶液去除未结合的染料，在4°C孵育4小时，并在10,000×g离心10分钟。弃去上清液，FF-sEVs沉淀重悬于100μL过滤的PBS中并保持在冰上。

对于成熟，标记的FF-sEVs添加到500μL预平衡的成熟培养基（38.5°C，5% CO₂）中含有60个COCs。阴性对照通过将PBS与标记染料（省略FF-sEVs）孵育制备，遵循相同协议，并将溶液添加到含有60个COCs的成熟培养基中。IVM 22小时后（38.5°C，5% CO₂），COCs在4%多聚甲醛中4°C overnight固定。样品用0.1% Hoechst 33342（泛核荧光染料）染色10分钟，安装在玻璃载玻片上（每张载玻片≤10个COCs）在DABCO-based antifade mounting medium中，并覆盖盖玻片。在同一天使用共聚焦显微镜（Leica Microsystems GmbH，韦茨拉尔，德国）进行成像。使用ImageJ软件v1.52d（Wayne Rasband，National Institutes of Health，USA）生成图像叠加。

实验设计和体外胚胎生产

本研究包括两个评估IVM期间FF-sEVs补充的实验。实验1检查了群体培养的卵母细胞，补充了0（对照）、5、10、25或50μg FF-sEVs蛋白/mL，而实验2评估了个体培养的卵母细胞，补充了0（对照）、6.5、12.5或25μg FF-sEVs蛋白/mL。为此，使用NanoDrop ND-1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE，USA）在280nm处量化每头小母牛的FF-sEVs蛋白浓度。通过将FF-sEVs稀释在含有0.1% BSA（Sigma A8806）的PBS中制备个体FF-sEVs储备溶液。为确保所有小母牛的平等贡献，储备溶液按比例合并并储存为0.5mL等分试样在-80°C。将合并的FF-sEVs等分试样解冻并在预平衡的成熟培养基（38.5°C，5% CO₂）中连续稀释以达到目标浓度。

卵巢从当地屠宰场收集，外部用96%乙醇消毒，并在温（37°C）生理盐水中冲洗，其中含有卡那霉素（50μg/mL）。使用18号针头和10mL注射器从窦卵泡（4–8mm直径）抽吸卵丘卵母细胞复合体。选择具有均匀颗粒化细胞质和≥3层紧凑卵丘细胞层的卵丘卵母细胞复合体用于IVM、体外受精（IVF）和体外培养（IVC），在群体和个体条件下，如先前所述，有轻微修改。

群体培养系统

对于IVM，批次60个COCs在500μL TCM-199中培养，补充有20ng/mL表皮生长因子、50μg/mL庆大霉素和指定浓度的FF-sEVs（0、5、10、25或50μg FF-sEVs蛋白/mL）。22小时后（38.5°C，5% CO₂），成熟的卵母细胞与通过Percoll梯度（45%/90%）纯化的冷冻-解冻公牛精子受精。精子浓度调整为1×10⁶/mL在IVF-TALP（碳酸氢盐缓冲的Tyrode's培养基，含有6mg/mL BSA [Sigma A8806]和20μg/mL肝素）。受精在500μL IVF-TALP中进行21小时（38.5°C，5% CO₂）。通过涡旋去除多余的精子和卵丘细胞，并将受精卵转移到50μL液滴的合成输卵管液（SOF）中，含有0.4% BSA（Sigma A9647）和ITS（5μg/mL胰岛素、5μg/mL转铁蛋白、5ng/mL硒）。25个受精卵的组在石蜡油（SAGE，Cooper Surgical）下培养，38.5°C，8天（5% CO₂，5% O₂，90% N₂）。

个体培养系统

培养基组成镜像群体培养条件，但所有步骤（IVM、IVF、IVC）在单个COC/受精卵液滴中进行。对于IVM，个体COCs在20μL液滴的TCM-199中成熟（补充有0、6.5、12.5或25μg FF-sEVs蛋白/mL）在石蜡油下（7.5mL在60×15mm Petri dishes中）。IVM后，受精在20μL IVF-TALP液滴中进行（1×10⁶精子/mL）21小时。无卵丘的受精卵转移到20μL SOF液滴中并个体培养8天，在相同的气体和温度条件下作为群体培养。

cleavage率在受精后45小时计算，作为 cleavage胚胎相对于假定受精卵的百分比。囊胚率在受精后第7和第8天确定，作为囊胚相对于假定受精卵的百分比。

囊胚的 differential apoptotic staining

体外生产的第8天囊胚在4%多聚甲醛中室温（RT）固定20分钟，并储存在4°C直到进一步处理。使用 adapted from Wydooghe et al. 的协议进行 differential staining。囊胚在0.5% Triton X-100和0.05% Tween-20在PBS中透化1小时，RT。通过用2N HCl（Tritipur?，Merck，德国；Cat. 1.09063.1000，Lot HC98019763）处理样品20分钟，RT，实现DNA变性，随后在100mM Tris–HCl（pH 8.5）中中和10分钟。胚胎然后在封闭溶液（10%山羊血清，0.5% BSA在PBS中；Gibco?，UK；Cat. 0000333482）中4°C overnight孵育。

对于 lineage-specific staining，囊胚与即用型小鼠抗-CDX2单克隆抗体（Biogenex，San Ramon，CA，USA）孵育 overnight，4°C，以标记内细胞团（ICM）。洗涤后，样品与兔抗-active caspase-3抗体（0.768μg/mL在封闭溶液中；Cell Signaling Technology，莱顿，荷兰；Cat. 9,664）孵育 overnight，4°C，以检测凋亡细胞。阴性对照省略一抗。 secondary staining涉及顺序 incubation与山羊抗-小鼠Texas Red-conjugated抗体（20μg/mL；Molecular Probes，Merelbeke，比利时；Cat. T-862）和山羊抗-兔FITC-conjugated抗体（10μg/mL；Molecular Probes；Cat. F-2765），每个1小时，RT。囊胚用Hoechst 33342（50μg/mL在PBS/0.1% BSA中；Molecular Probes；Cat. H3570） counterstained 20分钟，RT，以标记所有细胞核，并安装在DABCO antifade medium中（每张载玻片≤10个囊胚）。

安装的囊胚使用共聚焦显微镜（Leica Microsystems GmbH，韦茨拉尔，德国）成像。滋养外胚层（TE）细胞通过Texas Red荧光识别，而ICM细胞通过CDX2标记界定。总细胞数（TCN）计算为TE和ICM细胞核 stained with Hoechst 33342的总和。凋亡细胞（AC）基于FITC-positive caspase-3信号量化。ICM/TCN比率和凋亡细胞比率（ACR；AC/TCN）从这些计数中导出。使用ImageJ软件v1.52d（National Institutes of Health，USA）生成图像叠加。

统计分析

所有统计分析在RStudio（v4.2.1；R Core Team，维也纳，奥地利）中进行，以受精卵/胚胎为实验单位。 generalized linear mixed-effects models被拟合以评估不同浓度FF-sEVs补充（群体培养：0、5、10、25和50μg蛋白/mL；个体培养：0、6.5、12.5和25μg蛋白/mL）对胚胎发育结果的影响，包括 cleavage率和囊胚形成（受精后第7和第8天）。类似地， mixed linear regression models用于评估FF-sEVs补充对囊胚 differential staining参数（TE、ICM、TCN、ICM/TCN比率、AC和ACR）的影响。 replicate被包括为所有模型中的随机效应。通过 studentized residuals的散点图、线性预测器诊断和Shapiro–Wilk测试分别验证 homoscedasticity、linearity和normality的假设。违反 normality假设的连续变量（p < 0.05）使用 square root-、log2-或log10- transformations转换，之后残差满足 normality标准（Shapiro–Wilk p > 0.05）。使用Tukey's post hoc test进行FF-sEVs处理组之间的 pairwise comparisons，结果报告为 least squares means ± standard errors。分析使用R packages lme4、multcomp和multcompView，统计显著性定义为p ≤ 0.05。

结果

FF-sEVs的表征揭示了双层、球形颗粒，与EV形态一致，如TEM观察到的。纳米颗粒跟踪分析表明平均±SD颗粒大小为160.6±55.1nm（小母牛1）、164.6±73.8nm（小母牛2）、170.1±80.4nm（小母牛3）和157.0±61.4nm（小母牛4）。这些样品的蛋白浓度分别为30.34、28.13、23.81和20.93μg/mL。 Western blot，在四头小母牛的FF-sEVs池上 performed，确认了EV特异性标记物（CD9、CD63和TSG101）的存在。在成熟培养基中共同孵育22小时后，评估了荧光标记的FF-sEVs被COCs的摄取。成熟期后获取的共聚焦显微镜图像揭示了标记的FF-sEVs存在于卵母细胞的卵质和周围卵丘细胞的细胞质内。

群体培养的卵母细胞/受精卵的胚胎发育参数（n = 2,062 COCs在8个 replicates中）总结在 Table 1中。 cleavage率和第7天囊胚形成在组间没有差异（p > 0.38）。然而，对照组中的第8天囊胚率高于补充有FF-sEVs在10、25或50μg/mL的COCs（p < 0.02），而在对照组和5μg/mL FF-sEVs组之间没有观察到差异（p > 0.79）。

个体培养的卵母细胞/受精卵的胚胎发育参数（n = 540 COCs在8个 replicates中） presented在 Table 2中。 cleavage率和第7天囊胚生产在FF-sEVs-补充组（6.5、12.5或25μg/mL）和对照组之间没有差异（p > 0.19）。然而，在个体培养中补充6.5μg/mL FF-sEVs改善了第8天囊胚率，与所有其他组相比（p < 0.02）。在12.5μg/mL、25μg/mL和对照组之间没有观察到第8天囊胚生产的差异（p > 0.95）。

第8天囊胚的 differential apoptotic staining（ Table 3）表明，补充群体培养的卵母细胞/受精卵与25或50μg/mL FF-sEVs产生具有较低TCN的囊胚，与补充有5或10μg/mL FF-sEVs或对照组相比（p < 0.001）。值得注意的是，补充有50μg/mL FF-sEVs的COCs产生具有减少的ICM计数和较低ICM/TCN比率的囊胚，与所有其他组相比（p < 0.001）。补充有5μg/mL FF-sEVs产生具有最高ICM/TCN比率的囊胚，与所有其他组相比（p < 0.01）。在实验组之间没有观察到ACR的差异（p > 0.14）。

第8天囊胚的 differential apoptotic staining（ Table 4和 Figure 3） revealed that个体培养与6.5μg/mL FF-sEVs产生具有更高TCN和ICM计数的囊胚，与所有其他组相比（p < 0.001）。ICM/TCN比率在6.5μg/mL FF-sEVs组中也更大（p < 0.001）。相比之下，TE细胞计数和AC数量在组间没有显示差异（p > 0.34）。值得注意的是，ACR在6.5μg/mL FF-sEVs组中低于所有其他组（p < 0.001）。

讨论

我们调查了FF-sEVs在优化体外胚胎发育中的作用， specifically examining their dose-dependent effects in群体和个体培养系统。我们成功地从第一卵泡波的优势卵泡中分离出FF-sEVs，并证明了它们在IVM期间被卵母细胞和颗粒细胞内化。有趣的是，虽然群体培养的COCs和受精卵在FF-sEVs补充下没有显示发育改善，但在较高浓度下出现了 adverse outcomes（囊胚产量和TCN在FF-sEVs剂量≥25μg/mL时减少）。这种 inhibitory effect可能反映了外源性FF-sEVs和内源性 embryokines之间的竞争性干扰，这些 embryokines在群体培养期间在成熟培养基中 actively released。个体COC培养补充低FF-sEVs浓度（6.5μg/mL）表现出增强的发育能力，实现第8天囊胚生产率与群体培养的对应物相当。然而，在个体系统中增加FF-sEVs剂量没有产生 further benefit，突出了 narrow therapeutic window的存在。这些结果表明， calibrated FF-sEVs补充可以补偿个体COC培养中缺乏旁分泌信号。通过复制细胞间通信途径，FF-sEVs提供了一种新策略来 refine ART，特别是在单胚胎培养格式中，其中生理相互作用有限。

通过NTA表征FF-sEVs揭示了160–170nm的平均大小，与牛FF中报告的外泌体和微囊泡的典型大小范围一致，并在其他家畜物种的FF中。虽然外泌体起源于内吞途径并是组成型分泌的，但微囊泡通过质膜出芽在细胞激活期间形成。当前的命名法将 within this size range的囊泡分类为“小EVs”，并且 regardless of biogenesis，我们专注于它们的 embryotropic effects。使用Nanodrop测量的蛋白浓度（20–30μg/mL）也与先前研究一致。Asaadi et al.发现通过ODG UC分离的FF-sEVs表现出比通过 size-exclusion chromatography（SEC）分离的 those更低的蛋白浓度，因为ODG UC最小化污染蛋白质（例如脂蛋白）。然而，超速离心可能部分损害sEVs完整性 due to高 gravitational forces，导致sEVs损失。尽管存在此限制，ODG UC更好地保留sEVs的功能性货物（例如蛋白质、脂质和RNAs）与替代方法（例如多步超速离心或SEC）相比。支持这一点，我们先前的工作 demonstrated that ODG UC-分离的FF-sEVs来自排卵前卵泡 enhanced胚胎生产， whereas SEC-分离的FF-sEVs showed no effect。这些发现确认了ODG UC-分离的sEVs的 superior integrity和functionality， likely attributable to减少污染和保留的生物活性货物。

sEVs的生物活性取决于它们被受体细胞的内化。在家畜物种如牛、马和猫中，FF-sEVs已被显示与COCs相互作用，在IVM期间在卵丘细胞中 documented uptake。更最近，在马IVM模型中 also demonstrated that补充FF-sEVs到成熟培养基38小时导致sEVs吸收由颗粒细胞以及卵母细胞本身。类似地，在本研究中，FF-sEVs的内化通过它们在卵质内的定位确认，由卵膜的 distinct circular boundary界定，并在颗粒细胞内，如标记的FF-sEVs clustered在细胞质中 evidenced。虽然这些发现突出了COCs内化FF-sEVs的能力，但 governing this process的精确生理机制仍不清楚。在这方面， emerging evidence suggests that FF-sEVs可能通过双途径增强卵母细胞成熟：（1）调节颗粒细胞功能通过递送生物活性分子（例如miRNAs、蛋白质） that regulate steroidogenesis、apoptosis和cell-cycle progression和（2）直接影响卵母细胞能力通过转移代谢调节剂（例如ATP- generating enzymes）和抗凋亡因子。这些机制 collectively suggest that FF-sEVs作为细胞间通信的关键介质， bridging细胞支持和直接卵母细胞编程以优化成熟结果。

基于Asaadi et al.的发现， who demonstrated improved胚胎发育与12.5μg/mL FF-sEVs补充 during群体卵母细胞成熟，本研究测试了围绕该基准的浓度（0、5、10、25和50μg蛋白/mL）以评估 below、near和above此参考的响应，同时 acknowledging that dose–response relationships可能不是线性的。相反，对于个体培养系统，尚无先前研究在成熟期间补充FF-sEVs。然而，我们先前的工作 showed that补充FF在5和10%（v/v）在群体培养的COCs的成熟培养基中改善了 several囊胚质量参数与 controls相比。而在个体培养的COCs中， only 5% FF改善了囊胚质量参数以及囊胚生产。假设较低FF体积比例包含较少FF-sEVs，个体培养系统的浓度选择 within和below Asaadi et al.的 therapeutic window（6.5、12.5和25μg/mL）。此方法 also considered logical because IVM在群体培养系统中涉及每孔60个COCs，使得较高补充浓度比个体培养设置更合适，其中存在单个COC。有趣的是，因为IVP系统的改进 often arise from模仿体内条件，我们进行了一项初步研究（数据未显示），其中我们测试了较高FF-sEVs浓度在成熟培养基中（12.5、125和1,250μg蛋白/mL）以更接近 those present within卵泡。然而，浓度≥125μg蛋白/mL导致囊胚生产显著减少（<10%）。

观察到的差异 between our findings和 earlier studies，例如Asaadi et al.报告的群体培养中12.5μg/mL FF-sEVs的发育益处，可能源于sEVs的卵泡起源差异。具体地，本研究中的FF-sEVs从 presumably生长卵泡 during发情周期的黄体期（优势卵泡约8mm）分离， whereas Asaadi et al. utilized sEVs derived from排卵前卵泡（约15