病毒包膜胆固醇水平决定SARS-CoV-2及其他人冠状病毒感染性的机制研究及其治疗意义

《Frontiers in Microbiology》：Cholesterol in viral envelope determines infectivity of SARS-CoV-2 and other coronaviruses

本研究发现SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV等冠状病毒包膜中的胆固醇含量直接决定病毒 infectivity（感染性）。通过靶向胆固醇 depletion（消耗）和 replenishment（补充）实验证实，病毒包膜胆固醇 stoichiometry（化学计量）是调控宿主细胞 susceptibility（易感性）的关键分子决定因素。该研究为开发靶向病毒脂质组 remodel（重塑）的 host-directed（宿主导向） broad-spectrum antivirals（广谱抗病毒药物）提供了重要理论依据。

　　

引言

冠状病毒是一类系统发育多样性的包膜病毒，拥有已知最大的RNA基因组，其特征是正义单链RNA结构。SARS-CoV-2作为新型Betacoronavirus（β冠状病毒）支系成员，与SARS-CoV（2002年，中国）和MERS-CoV（2012年，阿拉伯）具有进化谱系关联。冠状病毒感染的第一步涉及刺突蛋白（S protein）与细胞进入受体的特异性结合。这种结合介导病毒-细胞粘附，进而诱导S蛋白构象变化，使病毒和细胞膜靠近，最终形成融合孔，病毒基因组通过该孔释放到宿主细胞质中。鉴于这些过程的膜依赖性特性，靶细胞膜中的胆固醇成为介导这些病理生理事件的关键决定因素。

除了促进SARS-CoV-2进入靶细胞外，宿主细胞的胆固醇富集膜微域（cholesterol-enriched membrane microdomains）对于子代病毒颗粒的组装也至关重要。在第一个复制周期后，系统性感染的建立需要大量生产子代病毒颗粒。鉴于缺乏内源性膜生物合成途径，新生病毒颗粒从宿主细胞获取脂质双分子层以组装其脂质包膜。靶向这一机制，SARS-CoV-2感染劫持宿主胆固醇运输以重塑膜胆固醇水平，从而决定新出芽病毒颗粒包膜中的胆固醇含量。

结果

25-羟基胆固醇处理在体外对人冠状病毒的进入没有显著抑制作用

25-羟基胆固醇（25-HC）是胆固醇25-羟化酶（CH25H）催化胆固醇羟基化的产物。25-HC已被证明对不同家族的包膜病毒具有广泛的抑制活性。25-HC在COVID-19感染患者中上调，并在体内发挥抗SARS-CoV-2活性。鉴于25-HC在选择性消耗宿主细胞质膜中可及胆固醇方面的既定作用，我们利用该化合物研究靶细胞膜胆固醇是否影响病毒进入。

我们首先通过标准CCK-8测定法测试了25-HC在Vero细胞中的细胞毒性。浓度高达12.5 μM时，25-HC没有明显的细胞毒性。为了确认25-HC调节质膜胆固醇的能力，使用胆固醇荧光探针filipin-III可视化25-HC处理后的Vero E6细胞胆固醇。共聚焦激光显微镜显示，未经处理的细胞中的胆固醇水平显著高于25-HC处理的细胞。此外，荧光信号随着25-HC浓度的增加而逐渐降低，表明25-HC以剂量依赖性方式消耗质膜胆固醇。

我们随后使用基于VSV的假型颗粒，这些颗粒包含了来自SARS-CoV-2原型株、新兴变体以及其他两种人冠状病毒SARS-CoV和MERS-CoV的刺突蛋白，以研究靶细胞膜胆固醇对病毒进入细胞的直接调节作用。Vero E6细胞用25-HC预处理，然后用这些表达荧光素酶的假病毒感染。有趣的是，我们观察到从质膜去除胆固醇未能降低假病毒感染性。类似地，将假病毒与12.5 μM的25-HC预孵育也对病毒颗粒的进入没有显著影响。

我们的结果表明，降低质膜胆固醇的25-HC并未抑制SARS-CoV-2及其变体以及SARS-CoV和MERS-CoV的病毒进入。然而，25-HC已被证明对人冠状病毒具有广谱抗病毒活性。这种明显的差异可能归因于胆固醇富集的宿主细胞膜在包膜病毒进入后过程中的重要作用，它们协调病毒复制区室的形成以及随后子代病毒颗粒的组装和出芽。因此，用25-HC处理宿主细胞选择性地阻断具有复制能力的真病毒感染，同时对单周期假型颗粒表现出可忽略的影响。

人冠状病毒病毒颗粒中的胆固醇与细胞感染性呈正相关

鉴于靶细胞的25-HC预处理在病毒进入模型中缺乏效力，我们假设来自宿主细胞的含有刺突蛋白的病毒膜内的胆固醇含量可能关键地决定人冠状病毒的进入效率。为了验证这一假设，我们应用甲基-β-环糊精（MβCD），一种直接“剥离”膜胆固醇而不扰乱细胞内胆固醇稳态的化合物，以描绘病毒颗粒相关包膜胆固醇对病毒进入的功能贡献。

通过CCK-8测定确定的2.5 mM最大非细胞毒性浓度的MβCD处理，在Vero E6细胞中诱导了近乎完全的膜胆固醇消耗，通过filipin-III荧光强度分析进行量化。我们随后在感染前直接将浓度梯度的MβCD与编码萤火虫荧光素酶的SARS-CoV-2假病毒一起孵育。值得注意的是，MβCD处理表现出有效的抗病毒效果，半数抑制浓度（IC₅₀）为0.21 mM。随后对SARS-CoV-2变体的评估揭示了可比的抗病毒效力，IC₅₀值低于0.5 mM。此外，对SARS-CoV（IC₅₀ = 0.77 mM）和MERS-CoV（IC₅₀ = 0.42 mM）观察到类似的抑制曲线，证实了广谱抑制效果。重要的是，在这些测定中，用于与病毒孵育的MβCD在感染时被稀释出样品，因此残留的MβCD对细胞膜胆固醇水平的影响极小。相比之下，细胞膜中MβCD诱导的胆固醇消耗导致抗病毒活性显著降低，证据是SARS-CoV-2原型和EG.5.1变体的IC₅₀升高超过10倍，其他变体株以及SARS-CoV和MERS-CoV的IC₅₀增加2~3倍。

使用表达EGFP的假病毒进行的平行实验显示了与荧光素酶测定相当的结果。使用MβCD从假病毒中提取胆固醇几乎完全消除了病毒感染性（在2.5 mM时抑制>90%）。即使在1.25 mM的较低浓度下，我们也观察到GFP荧光减少约60%。类似地，Vero E6膜中MβCD介导的胆固醇消耗显示对病毒进入的抑制比病毒包膜胆固醇调节弱约50%。

冠状病毒通过两种途径进入细胞：在质膜融合或在内涵体中融合，这取决于细胞类型。我们接下来研究了通过病毒包膜中胆固醇消耗抑制病毒进入是否表现出仅限于Vero E6细胞的细胞类型特异性，或代表了更广泛的细胞机制。为了解决这个问题，我们量化了人冠状病毒进入Caco-2细胞的情况，这些细胞主要通过直接融合途径感染。这些实验中使用的MβCD浓度是非细胞毒性的。我们发现，从病毒包膜中消耗胆固醇完全阻断了SARS-CoV进入Caco-2细胞，而Caco-2膜胆固醇提取仅实现了部分抑制。这些数据共同表明，与宿主膜胆固醇相比，病毒包膜胆固醇在介导人冠状病毒细胞进入中起着更关键的作用，病毒颗粒相关胆固醇水平作为感染潜力的关键调节剂，与进入途径无关。

验证病毒包膜胆固醇作为人冠状病毒感染的关键因素

理论上，如果MβCD介导的病毒颗粒内胆固醇消耗对细胞进入至关重要，那么胆固醇补充应该恢复MβCD处理的冠状病毒受损的感染性。为此，我们进行了一项功能性胆固醇拯救实验，以确认病毒颗粒膜内胆固醇的作用。我们向用MβCD处理的细胞补充了环糊精复合物中的外源性胆固醇，浓度为250 μg/mL，并发现可及胆固醇的消耗可以通过向细胞培养物中添加可溶性胆固醇来挽救。

SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV假病毒首先用MβCD处理，然后在有或没有预先补充胆固醇的情况下评估细胞进入效率。正如预期的那样，胆固醇补充恢复了包膜胆固醇耗竭假病毒的进入能力，对于SARS-CoV-2原型株、BA.2.86/EG.5.1/JN.1变体、SARS-CoV和MERS-CoV，恢复高达60%。此外，对于XBB.1.5变体，恢复达到了90%。这些发现共同支持了病毒颗粒膜胆固醇含量负责冠状病毒进入效率的概念，并且MβCD介导的病毒颗粒内胆固醇消耗的抑制效果在胆固醇补充后表现出部分可逆性。

鉴于MβCD在消耗病毒颗粒相关和宿主膜胆固醇方面的双重抑制能力，我们询问这种抑制是否通过相同的机制实现。为了解决这个问题，Vero E6细胞用MβCD单独预处理或在MβCD处理后进行胆固醇补充，随后用假病毒攻击。值得注意的是，胆固醇补充完全恢复了多个测试毒株的病毒进入能力，包括SARS-CoV-2（原型和XBB.1.5/JN.1变体）、SARS-CoV和MERS-CoV。这些数据表明，宿主细胞质膜胆固醇补充促进了病毒进入效率的恢复显著大于病毒包膜胆固醇重建。这种功能差异可能源于病毒包膜中S蛋白的胆固醇依赖性结构完整性，其中胆固醇消耗诱导的构象改变表现出不可逆的特征，胆固醇重新插入无法完全纠正。

宿主细胞膜胆固醇的动态调节直接控制子代冠状病毒病毒颗粒的感染性

为了确定受损的病毒感染是否确实是由于病毒包膜中胆固醇积累减少所致，我们随后表征了在胆固醇限制宿主细胞条件下组装的人冠状病毒病毒颗粒的感染性。为此，表达刺突蛋白的HEK293T细胞用25-HC预处理，以诱导从质膜内化可及胆固醇，随后感染G*ΔG-VSV，这产生了包膜胆固醇含量降低的子代冠状病毒。

通过针对VSV-L基因片段的RT-PCR定量病毒基因组，将病毒颗粒数量标准化，然后进行同步感染测定。我们的结果表明，在25-HC处理的HEK293T细胞中产生的SARS-CoV-2原型和EG.5.1几乎完全丧失了进入能力。定量上，JN.1和BA.2.86的进入效率分别相对于未处理的对照降低了80%和50%。此外，在相同条件下产生的SARS-CoV假病毒显示感染率降低了30%。有趣的是，向在25-HC处理的细胞中产生的冠状病毒病毒颗粒补充外源性胆固醇未能恢复感染性。值得注意的是，XBB.1.5表现出与其他SARS-CoV-2变体不同的特征，胆固醇补充可以挽救其感染性。这些差异的机制基础值得未来探索。这些结果共同确立了病毒包膜胆固醇作为人冠状病毒感染性的关键决定因素，并表明胆固醇去除诱导的病毒包膜重构损害了包膜完整性，产生永久性感染无能的病毒颗粒。我们的数据支持一个机制模型，其中25-HC可能通过改变子代病毒颗粒包膜中的胆固醇水平来发挥其抗病毒活性。

人冠状病毒包膜中的胆固醇缺乏损害病毒与宿主细胞的附着

我们接下来探索了包膜胆固醇消耗限制冠状病毒感染的机制。我们检查了包膜胆固醇是否为人冠状病毒进入所必需，通过允许病毒附着于易感细胞。人冠状病毒颗粒用MβCD预处理，随后在4°C下与Vero E6细胞孵育，该温度条件选择性地允许病毒附着同时阻止膜融合。通过RT-qPCR定量细胞相关病毒基因组显示，在MβCD介导的胆固醇消耗后，表面结合的病毒RNA减少了约50%，证实了病毒包膜胆固醇依赖性结合受损。然而，宿主细胞的MβCD预处理对病毒附着效率没有显著影响，表明MβCD阻断了人冠状病毒刺突介导的与质膜的融合，从而抑制病毒进入。

讨论

包膜病毒高度依赖其脂质包膜来感染宿主细胞。SARS-CoV-2通过ERGIC介导的出芽组装其宿主来源的脂质包膜，这一过程需要胆固醇丰富的微域。我们的研究结果表明，SARS-CoV-2和相关冠状病毒的包膜胆固醇是直接决定其感染性的关键因素。从病毒包膜中消耗胆固醇显著降低了病毒感染性，而胆固醇补充恢复了病毒进入效率。在生产者细胞中并行消耗减少了病毒颗粒胆固醇掺入，产生感染性较低的病毒颗粒。因此，干扰病毒脂质代谢可能减少COVID-19重症患者的临床并发症。我们的数据阐明了一种潜在的病毒策略，涉及操纵包膜胆固醇以调节β冠状病毒中的宿主细胞易感性。需要进一步的结构和功能研究来确定病毒包膜内最佳胆固醇比例所需的病毒感染性。

我们观察到宿主细胞的25-HC预处理并未显著影响SARS-CoV-2进入，而高剂量MβCD处理诱导了中度病毒抑制，表明需要深刻的宿主膜胆固醇去除才能实现显著的病毒进入抑制。值得注意的是，我们的结果表明，与宿主膜处理的对照相比，病毒颗粒中MβCD介导的胆固醇消耗使细胞感染性降低了2倍，证明了病毒包膜胆固醇在病毒-宿主膜结合中的主导作用。我们推测，在SARS-CoV-2病毒颗粒和宿主膜之间观察到的病毒进入的差异胆固醇需求可能部分归因于它们不同的膜结构，特别是不同的脂质-蛋白质比率以及膜曲率。事实上，包膜病毒进入对病毒包膜胆固醇水平的敏感性是一个普遍特征，如在甲型流感病毒、HIV-1和单纯疱疹病毒1型中观察到的那样。这种保守的胆固醇感应机制反映了对包膜膜生物物理适应的进化选择，以增强病毒传播效率。

应该指出的是，连接病毒包膜胆固醇和SARS-CoV-2感染性的精确机制仍不清楚。病毒包膜胆固醇可能通过调节膜流动性、维持病毒颗粒内S蛋白三聚体的四级结构、优化宿主-病毒界面处的膜曲率兼容性以及热力学稳定融合孔发育来促进SARS-CoV-2细胞进入。此外，SARS-CoV-2已被证明利用感染细胞中的胆固醇运输和合成来增强其感染性，因此我们不能排除病毒包膜胆固醇可能通过涉及免疫逃避的脂质介导的细胞信号传导在进入步骤之外调节病毒感染性的可能性。

在SARS-CoV-2大流行的初始阶段，流行病学数据显示，SARS-CoV-2表现出 distinct age-related progression to critical illness，同时表现出对患有慢性疾病如高血压、糖尿病和心血管疾病的患者的 particular predilection。感染后疾病的严重程度由病毒复制动力学和子代病毒颗粒的感染潜力决定。我们提出的模型假设，年龄相关的肺细胞胆固醇积累通过新生病毒颗粒中胆固醇富集病毒包膜组装介导的增强病毒进入，增强了新生冠状病毒病毒颗粒的感染性，这种机制在患有代谢合并症的患者中类似。这一模型得到了以下发现的支持：在APOE KO Huh7细胞中，SARS-CoV-2感染大大增加，这些细胞与WT细胞相比表现出增加的胆固醇积累。总之，我们的数据为先前证明宿主胆固醇调节干预措施具有泛冠状病毒抑制效力的研究提供了部分机制见解。未来的研究应描绘动脉粥样硬化斑块相关动脉微环境是否促进包装具有增强感染性特征的SARS-CoV-2病毒颗粒，与非动脉粥样硬化血管段相比。

宿主细胞中的正常脂质代谢因病毒感染而改变。已有研究表明，包膜的脂质组谱在病毒感染性中起着关键作用，在包膜病毒形态发生过程中发生特定脂质种类的时空分选。除了胆固醇外，病毒包膜中其他脂质成分的功能作用及其对病毒发病机制的贡献也需要进一步阐明。

本研究的一个限制是在整个实验研究中完全依赖VSV假病毒系统。虽然这种方法为研究病毒进入过程的特定方面提供了一个有价值且安全的模型，但它们固有地缺乏真实、具有复制能力的活病毒的完整生物复杂性。未来在适当的生物安全防护下使用真实活病毒测定进行验证对于确认这些观察结果的生物学相关性和转化潜力至关重要。此外，迫切需要利用冠状病毒感染和发病机制的动物模型进行体内研究，以表征靶向病毒脂质组的抗病毒化合物的治疗潜力和生理影响。

SARS-CoV-2关注变体（VOC）正在出现和传播，SARS-CoV-2大流行很可能在可预见的未来仍然是一个全球健康威胁。我们的数据支持病毒脂质靶向抗病毒药物与靶向SARS-CoV-2复制周期细胞内阶段的抑制剂（如3CLpro（主要蛋白酶）或RdRp（RNA依赖性RNA聚合酶）的协同药物组合。