非接触式冷大气等离子体气溶胶（CAP-A）技术的抗菌效能评估：一项突破性的体外与体内研究

本文推荐一项创新研究，系统评估了非接触式冷大气等离子体气溶胶（CAP-A）技术在体表微生物削减中的应用。研究显示，CAP-A在体内外均能实现高效抗菌（平均对数减少值达4.77），效果媲美酒精消毒（p=0.134），且无热损伤或臭氧蓄积等副作用，为临床感染控制提供了安全可靠的替代方案。

　　

1 引言

等离子体作为物质的第四态，是由带电粒子组成的部分电离气体。冷大气等离子体（Cold Atmospheric Plasma, CAP）因其抗菌特性在医疗应用中备受关注。尤其由氧气和水蒸气产生的等离子体能够通过电离过程中的能量转移生成活性氧物种（Reactive Oxygen Species, ROS），从而改变表面、液体甚至周围空气的特性。以往研究多集中于直接等离子体应用，即等离子体直接作用于目标表面。这类方法在伤口清洁中表现出强大的杀菌效果，能有效减少细菌负荷，且不受伤口大小、位置或共存因素（如吸烟、心血管疾病）的影响。例如，Daeschlein等人证实了CAP对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌乃至耐药菌株（如MRSA和MRGN）的体内有效性，表明冷等离子体通过破坏微生物结构以规避典型耐药机制。

伤口pH值在等离子体处理后下降，进一步佐证其抗菌效力，因为致病菌通常碱化伤口环境，而CAP处理可恢复酸性微环境以促进愈合。研究还报道CAP能显著加速伤口愈合，愈合率最高可比单纯支持疗法提高60%。这些改善与伤口类型或位置无关，其主要机制归因于抗菌作用，暗示间接等离子体方法可能取得类似效果。

在此基础上，一种新型间接等离子体方法——冷大气等离子体气溶胶（CAP-A）被提出。CAP-A将CAP产生的活性物种与雾化水结合，实现抗菌作用而无须等离子体源与处理表面直接接触。能量输入仅限于等离子体生成，使该方法在临床应用中更安全、灵活。间接方法如CAP-A通过氧化还原破坏靶向 transient 皮肤菌群，诱导微生物膜发生“选择性短路”，瓦解膜电位并禁用跨膜运输。

重要的是，这些效应具有高度选择性。由于人类细胞受到保护性抗氧化酶（如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和α-1-抗胰蛋白酶）的作用，不受影响。CAP-A的毒理学评估，包括Ames试验（EN ISO 10993-3）和细胞毒性试验（EN ISO 10993-5），证实其安全性。在细菌或人类细胞中均未检测到致突变或细胞毒性效应。直接CAP设备的临床使用也未显示不良反应，强化了该新兴技术的生物选择性和临床安全性。

本研究基于先前工作，证明了CAP-A技术在多种实验和实际场景中的杀菌效力，包括医院常规条件下对热敏医疗器械的消毒以及兽医临床感染的成功治疗。本研究首次按照EN 1500标准，在人体皮肤上使用指定测试菌进行体内评估，以获取清晰的统计和临床证据。测试设置结合了两种评估等离子体技术的标准：EN 1500是临床环境中表面活性微生物负荷减少最接近CAP-A的标准，而DIN SPEC 91315定义了等离子体源灭活效力的测量。这两种分别针对化学消毒剂（EN 1500）和等离子体设备（DIN SPEC 91315）的规范证明了CAP-A微生物灭活结果的可靠性。

2 相关主题分节

2.1 工作原理

PLASMO?HEAL设备（WK-MedTec GmbH, Bückeburg）采用间接等离子体方法工作。定义的交流电压（1.45 kV，38 kHz，正弦波）从环境空气产生冷等离子体反应产物，主要是羟基自由基，仅产生可忽略量的臭氧。蒸馏水（根据德国药典稳定化处理以确保卫生）经超声波雾化，并被等离子体富集空气激活，从而增加气溶胶的电物理潜能而不改变其材料组成。所得气溶胶（CAP-A）随后在距目标表面（如皮肤或伤口）7.5 cm处应用三分钟，按照制造商操作说明以确保处理区域均匀分布和最佳抗菌效力。根据EN 1500测试条件，本研究中处理后采样在应用后40分钟进行，以允许对抗菌效果的中期持久性进行初步评估。

2.2 体外测试

根据DIN 91315:2014，针对五种标准微生物（金黄色葡萄球菌ATCC 6538、表皮葡萄球菌ATCC 14990、大肠杆菌NCTC 10538、铜绿假单胞菌ATCC 10145和白色念珠菌ATCC 10321）评估微生物减少效力，每种微生物测试三次。通过革兰染色、代谢谱和吲哚产生确认微生物鉴定。培养物在Caso琼脂上于60-mm培养皿中生长，并用无菌无热原0.9% NaCl调整至McFarland标准8。微生物悬浮液使用无菌拭子应用于不锈钢试样（100 × 10 × 1 mm；表面粗糙度100 μm），随后浸渍五秒、排水并空气干燥两小时。试样然后暴露于PLASMO?HEAL气溶胶三分钟。通过涡旋每个样品于10 mL无菌0.9% NaCl中30秒回收微生物；系列十倍稀释（有效稀释从100到10^?3）与未处理对照一起铺板（每稀释度0.1 mL）。孵育后，利用菌落计数（来自含10–100菌落的平板）计算微生物负荷并确定对数减少因子。

2.3 体内测试

根据EN 1500，使用大肠杆菌NCTC 10538（一种用于标准化手部消毒测试的非致病性参考菌株）评估体内抗菌效力。18名受试者作为医院手部卫生质量保证的一部分参与（非临床试验）。双手通过将手指浸入测试悬浮液五秒污染，然后排水。左手提供处理前细菌计数，而右手污染后暴露于PLASMO?HEAL气溶胶三分钟，然后进行处理后采样。系列稀释和培养方法类似于体外程序，产生对数减少因子。大肠杆菌作为一种非致病性但强韧的微生物，是致病微生物的合适替代物。受试者数量（n=18）根据EN 1500要求确定，以确保对手部消毒程序评估具有足够统计显著性。所有程序均按照相关指南进行；参与者提供书面知情同意，机构审查委员会获得伦理豁免（招募时间：2023年1月2日至9日）。

2.4 统计分析

使用IBM Statistics Version 30 for Mac进行描述性和推断性统计。鉴于样本量小，Shapiro–Wilk检验评估log-CFU参数的正态性（处理前：p=0.025；处理后：p=0.191）和对数减少因子（p<0.001），仅处理后log-CFU值确认正态分布。模拟研究支持t检验对正态性违抗的稳健性。因此，配对样本t检验（α=5%，双尾）比较体内测试中处理前后log-CFU值，而独立样本t检验（α=5%，双尾）， preceded by Levene方差齐性检验（p=0.0502），比较CAP-A与酒精参考消毒之间的log-CFU减少因子。完整数据集作为电子补充材料提供。

3 结果

体外结果详细分析（表1）和体内结果（表2）提供了这种创新伤口治疗方法动态效应的全面评估。在采用CAP-A程序的体内评估中，应用前平均log CFU为7.23（SD ± 0.59），程序后降至2.52（SD ± 0.38），产生平均对数减少因子4.77（SD ± 0.44）。配对样本t检验确认log CFU值减少具有统计显著性（p<0.001）。此外，CAP-A处理与酒精参考消毒之间的log CFU减少因子比较显示无显著差异，由Levene方差齐性检验（p=0.0502）和独立样本t检验（p=0.134）表明。基于体内结果，CAP-A程序实现了超过4-log减少的消毒效力，从而确认其有效性。而且，统计分析显示CAP-A方法与酒精参考消毒无显著差异，表明两者性能等效，尽管当前EN 1500标准尚未 tailored 以适应此类创新方法。

4 讨论

本研究使用WK-MedTec GmbH PLASMO?HEAL设备针对测试微生物大肠杆菌评估了CAP-A程序的体内抗菌效力。我们的发现显示平均对数减少因子为4.77，表明强大的抗菌效应且具有统计显著性。结合先前关于CAP干预的报道，这些结果表明CAP-A可实现与其他CAP方法文献记录相当的抗菌减少范围，尽管研究间在测试微生物、暴露时间、设备配置和应用部位存在差异。例如，Zimmermann等在体外实现平均对数减少因子超过3 CFU，而Boekema等报道体内对数减少因子为2.9。类似地，Perni等证明2.5分钟CAP处理后减少因子为2.5。相比之下，本研究达到的值4.77支持将CAP-A视为直接CAP的可行、符合EN 1500的替代方案。Lan等已显示CAP和CAP-A技术均能产生高对数减少因子。然而，在CAP程序与增高功率输入及随之而来的效应（如硝酸盐和臭氧产量增加以及局部温度升高）相关的情况下，CAP-A似乎可实现相当的细菌灭活，同时可能减少这些次要副作用。除抗菌效力外，还评估了潜在皮肤相关不良反应。根据DIN EN ISO 10993-23:2021–10进行的皮肤刺激测试显示在任何观察点无红斑或水肿证据，产生原发性刺激指数（P. I. I.）为0.0。这些发现表明，按本研究描述应用CAP-A处理不太可能诱发皮肤刺激，支持其重复或延长临床使用的潜在适用性。特别是，CAP-A的较低能量需求结合其高抗菌效力，使其在需要最小化热改变和化学副产物的应用中成为有前途的替代方案。

尽管当前文献库未提供CAP程序可达到的汇总对数减少因子的详尽描述，但此处呈现的结果强调现代CAP-A技术未必逊色。相反，本研究中达到的4.77对数减少因子支持CAP-A可作为传统CAP方法有效替代的假设，而无伴随的活性物种产量增加和热副作用缺点。

根据EN 1500和DIN SPEC 91315，选择大肠杆菌NCTC 10538进行体内评估以确保与既定消毒剂测试协议的标准化和可比性。体外部分旨在将评估扩展到更广微生物谱，包括革兰氏阳性和阴性细菌，从而在等离子体基和化学消毒剂认可验证标准框架内实现代表性评估。总之，我们的发现表明CAP-A通过实现显著体内对数减少因子同时减轻常规CAP处理中 noted 不良反应，具有作为替代抗菌策略的巨大潜力。本研究为进一步调查CAP与CAP-A程序的比较效率和机制基础提供了有意义推动力。

5 局限性与未来研究

本研究存在某些局限，在解释结果时应予考虑。体内评估仅在健康志愿者上按照标准化EN 1500条件进行，可能未完全反映临床环境（如慢性伤口护理或高污染场景）的复杂性。使用单一非致病性测试微生物（大肠杆菌）提供了受控模型，但未考虑实践中遇到的微生物谱，包括耐药菌株、孢子形成菌或真菌生物膜。此外，相对较小的样本量可能限制个体间变异的检测，且研究未调查可能的累积效应或微生物减少随时间的持久性。因此，未来研究应聚焦于评估CAP-A在具有不同皮肤状况、免疫力受损或现存感染的患者群体中的表现。而且，在现实临床工作流程约束下的研究，包括与现有卫生协议的整合，将很重要。本研究中，处理后微生物计数在3分钟CAP-A应用后40分钟获取，按照设备操作协议推荐。虽然此间隔在EN 1500条件下提供中期持久性的初步指示，但它不能替代抗菌持久性的专用长期评估。

鉴于这些观察，我们主张进行进一步比较研究，并行检查CAP和CAP-A技术。未来研究应拓宽测试微生物谱，纳入能量消耗和患者舒适度等额外参数，并在延长随访研究中严格评估这些抗菌方法的短期和长期益处和风险。此类研究可阐明驱动效力和副作用谱差异的潜在机制，最终有助于优化临床和工业环境中的等离子体基治疗。

6 结论

本研究证明CAP-A方法，如应用PLASMO?HEAL设备，在体外和体内均实现强大抗菌活性。CAP-A在体外对五种标准微生物持续实现高对数减少因子，体内针对大肠杆菌的测试显示平均减少4.77，超过临床相关阈值4。重要的是，CAP-A的性能在统计上等效于酒精参考方法，同时额外避免常规CAP技术的潜在缺点。这些结果将CAP-A定位为有前途的替代抗菌策略，具有高效力、良好安全性和更广临床适用性。通过结合非接触应用和微生物灭活，CAP-A在组织保存和患者舒适度至关重要的情境中提供优势。未来研究应扩展目标微生物范围，评估长期安全性，并在标准化临床条件下比较CAP-A与其他新消毒技术。将CAP-A作为标准化辅助治疗步骤整合入临床协议可能代表一种有效、患者友好的创新。CAP-A有潜力改善人类和兽医医学中的感染控制和伤口护理。