野生大豆盐碱胁迫应答机制研究：根系钠离子区隔化与转录组调控解析

本研究系统揭示了野生大豆（Glycine soja）响应盐（NaCl）与碱（Na2CO3-NaHCO3）胁迫的生理与分子机制，发现其通过根系Na+区隔化、茎部K+缓冲（维持高K+/Na+比）及类黄酮生物合成通路（如CHS、FLS、CYP75B1等基因）激活协同增强抗逆性，为作物抗盐碱育种提供关键靶点与理论依据。

　　

盐和碱胁迫对大豆生产力构成主要限制，但其在早期发育阶段的特异性影响尚未被充分认知。野生大豆（Glycine soja）作为抗逆性遗传资源，在盐（0.6%和1.2% NaCl）和碱（pH 9.16）胁迫下通过萌发、幼苗性状、离子积累和转录组响应进行评估。盐胁迫下部分萌发仍可进行，而碱胁迫则完全抑制胚根出现。幼苗生长和株高在盐胁迫下表现出一定耐受性，但高pH导致严重萎蔫和死亡。离子分析显示，盐胁迫下根中Na⁺区隔化伴随茎中K⁺缓冲，而碱胁迫将Na⁺限制在根部，维持最高的茎K⁺/Na⁺比率。生物富集和转运因子在0.6% NaCl时达到峰值。转录组分析鉴定出7,355个差异表达基因（DEGs），分为五个簇，富集于苯丙烷/类黄酮生物合成和激素信号通路。盐胁迫上调FLS、F3H和F3′5′H等基因，碱胁迫诱导CHS、过氧化物酶和CYP75B1。离子转运调控存在差异，盐胁迫激活HKT1和KT11，碱胁迫激活NIP5–1。在385个转录因子（TF）相关DEGs中，MYB、ERF、bHLH和WRKY占主导（占总量的67%），盐胁迫下观察到复杂的TF-基因网络。外源类黄酮（芦丁、圣草酚）处理在盐和碱胁迫下增强了叶面积、根长和株高。这些结果表明，G. soja通过根Na⁺区隔化、胁迫响应基因调控和类黄酮介导的生长增强来减轻离子毒性，为了解盐碱胁迫下的适应机制提供了见解。

1 引言

土壤盐碱化导致的盐碱胁迫已成为全球主要环境挑战，严重损害农业生产力和生态稳定性。全球超过6%的土壤已受盐碱影响，不可持续的灌溉和过量施肥通过次生盐碱化加剧土地退化。预计到2050年，约50%的耕地可能盐碱化。盐碱土壤分为中性pH土壤（富含NaCl和Na₂SO₄，pH～7）和高pH苏打土壤（富含Na₂CO₃或NaHCO₃，pH>8.5）。盐胁迫通常诱导渗透胁迫和离子毒性，而碱胁迫因pH升高造成额外损害，比单独盐胁迫更严重。高浓度碳酸盐（CO₃^2?）和碳酸氢盐（HCO₃^?）离子导致碱性土壤pH和植物养分有效性降低。与中性盐土不同，高pH盐碱土进一步抑制必需养分吸收和钠离子（Na⁺）排斥。此外，高碱胁迫诱导过量活性氧（ROS）积累，造成细胞蛋白、脂质和DNA氧化损伤，可能导致细胞凋亡。栽培大豆（Glycine max L.）从其野生祖先Glycine soja驯化而来，此过程仅保留约50%的基因，导致许多胁迫适应基因丢失。因此，野生大豆是增强栽培品种耐盐碱的宝贵遗传资源。研究表明，野生大豆比栽培品种保持更高遗传多样性和对非生物胁迫的优异适应性。例如，在盐碱胁迫下，野生大豆积累更高浓度的渗透保护剂如脯氨酸和甘氨酸甜菜碱，有助于维持渗透平衡和保护细胞结构。此外，与盐敏感栽培大豆种质相比，野生大豆在盐胁迫下叶片和根中Na⁺积累显著更低，K⁺保留更高，因而K⁺/Na⁺比率更高。然而，先前对野生大豆的研究仅专注于其对盐或碱胁迫的单独响应，直接比较野生大豆对两种胁迫的生理和分子反应的研究仍然有限。鉴定野生大豆中的抗逆基因并将其用于栽培种质可增强抗逆性和整体作物品质，同时解决遗传多样性有限和环境适应性不足的问题。本工作的目标是（i）在生理、生化和分子水平检查野生大豆对盐和碱胁迫的响应，及（ii）研究其耐受这些胁迫的机制。此工作不仅有助于提高大豆育种中的耐盐碱性，还为植物胁迫响应和环境适应性的更广泛分子机制提供重要见解。

2 材料与方法

2.1 植物材料

野生大豆种子采自中国山东省东营市（37°17053.4500 N, 118°37015.0400 E）。种子为单株野生大豆自交后代，储存于实验室条件下供实验使用。

2.2 种子预处理、胁迫应用和植物生长条件

为提高野生大豆种子萌发率，种子用浓硫酸浸泡并反复搅动以破坏泥膜。处理后，种子用去离子水彻底冲洗三次，随后用于实验。盐胁迫处理使用0.6%和1.2% NaCl溶液（溶于1/20强度Murashige和 Skoog (MS)培养基）。碱胁迫处理使用Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液（同样在1/20 MS中）在pH值9.16（0.1M Na₂CO₃:0.1M NaHCO₃ = 1:9）、9.90（5:5）和10.83（8:2）。无NaCl或碱缓冲液的1/20 MS溶液作为对照。

对于盐和碱胁迫下的生长实验，种子播种于蛭石并用1/20 MS溶液灌溉。三周后，均匀幼苗暴露于相应盐碱处理。每处理每重复32株幼苗，每处理三个重复。处理后第三和第七天拍摄地上部分照片。处理7天后，根、茎和叶组织收获，立即浸入液氮，储存于-80°C供后续生理、生化和转录组分析。种子萌发和植物生长条件遵循先前方案，包括16:8 h光暗光周期，温度范围20-22°C，相对湿度65-75%。

2.3 钠和钾含量测量

Na⁺和K⁺浓度测定遵循修改自先前研究的方案。简言之，0.25 g烘乾粉末植物组织用5 mL HNO₃在110°C消化约6小时直至溶液清澈无色。冷却后，消化样品用去离子水稀释至10 mL体积。Na⁺和K⁺含量使用光学发射光谱仪（ICP-OES, Optima 8000, PerkinElmer, USA）测量。

2.4 生物富集因子和转运因子计算

生物富集因子（BF），代表植物吸收和保留离子的能力，根据先前描述的方法稍作修改确定。BF计算为植物组织（根、茎、叶；mg kg^-1干重）中Na⁺含量与其在土壤中相应浓度的比率。转运因子（TF），指示离子从根向地上部转运效率，计算为地上部Na⁺含量与根中Na⁺含量的比率，均以干重基础表示（mg kg^-1）。

2.5 转录组测序和KEGG富集分析

总RNA从盐胁迫（0.6% NaCl和1.2% NaCl）、碱胁迫（pH=9.16）和对照条件下幼苗根组织提取，使用EasyPure?植物RNA试剂盒（ER301-01, TransGen Biotech）。RNA质量使用1%琼脂糖凝胶、2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies, USA）和NanoDrop2000分光光度计（Thermo FisherScientific, USA）评估。高质量RNA用于文库构建和测序，由上海迈邦生物医药科技有限公司（上海，中国）进行。原始读段使用FASTP过滤，清洁读段使用HISAT2比对参考基因组。转录本组装使用StringTie进行。每处理三个生物学重复。转录本表达水平使用每百万读段转录本数（TPM）方法量化。差异表达基因（DEGs）使用DESeq2, DEGseq, edgeR, Limma或NOIseq工具识别（阈值：P-调整 ≤ 0.05 且 |log₂ 倍数变化| ≥ 1）。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析使用KOBAS数据库进行，以阐明与DEGs相关的代谢通路和生物学功能。

2.6 类黄酮补充实验

野生大豆幼苗如上培养。三天龄幼苗一半接受100 μM类黄酮芦丁和圣草酚三天，然后所有幼苗用0.6% NaCl、1.2% NaCl或Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液（pH=9.16）处理，而用1/20 MS溶液灌溉的幼苗作为对照。胁迫暴露五天后，所有组测量株高、根长和叶面积。

2.7 RNA提取和反转录定量PCR

总RNA从样品使用RNA Kit试剂（Vazyme Biotech, China）按照制造商说明分离。第一链cDNA使用HiScript II第一链cDNA合成试剂盒（Vazyme Biotech, China）按照制造商协议合成。RT-qPCR使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme Biotech）进行。GsGAPDH用作内参基因。每样品三个生物学重复分析，相对表达水平使用2^?△△Ct方法获得。

2.8 数据分析

所有数据进行单因素方差分析（ANOVA），均值使用Tukey事后检验在P < 0.05水平比较，使用SPSS软件v 17.0（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）。

3 结果

3.1 盐和碱胁迫抑制野生大豆萌发和幼苗发育

盐和碱胁迫显著抑制野生大豆（G. soja）萌发和早期发育。值得注意的是，碱胁迫对种子萌发的抑制效应大于盐胁迫。在pH 10.83，未观察到明显萌发迹象。在较温和碱处理（pH 9.9和pH 9.16），胚根出现仅限于种皮穿透，而对照种子发育完全伸展的胚根和伸长子叶。相反，0.6%和1.2% NaCl处理的种子显示胚根出现，表明抑制较温和，但发育仍减少相对于对照。0.6%盐胁迫下萌发性能显著优于1.2%盐胁迫。在幼苗阶段，野生大豆表现出比萌发阶段改善的抗逆性。盐（0.6%和1.2% NaCl）和碱（pH=9.16）胁迫处理幼苗与对照相比无显著差异。然而，pH 10.83处理幼苗在3天内显示严重萎蔫，第7天接近完全死亡。胁迫暴露7天后，株高测量显示处理植物较对照略有减少；但差异无统计学意义。这些发现表明短期盐碱胁迫对幼苗早期垂直生长影响最小。

3.2 根是野生大豆主要钠积累器官

盐胁迫下离子分析显示从根到叶Na⁺含量逐渐增加，根中积累最高在1.2% NaCl。相反，碱胁迫下Na⁺主要局限于根。K⁺在所有盐胁迫水平主要集中于茎，最高水平在茎和叶中检测到在1.2% NaCl，其次碱胁迫（pH 9.16）在茎。K⁺/Na⁺比率在盐胁迫下所有组织显著降低，尤其在根，但向茎和叶显示适度增加。碱胁迫下，茎维持所有组织中最高K⁺/Na⁺比率，表明其在离子稳态中的关键作用。这些结果表明野生大豆通过根局部Na⁺保留和茎基K⁺缓冲机制减轻离子毒性。

与组织离子含量一致，生物富集因子（BF）在所有处理根中最高，超过值1.44在0.6% NaCl，1.23在1.2% NaCl，和1.00在碱性条件（pH 9.16）。最大BF在0.6% NaCl根中观察到。此外，茎BF在0.6% NaCl也超过1（1.18）。最高转运因子（TF）在0.6% NaCl处理植物记录；然而，TF值在所有处理保持低于1，最低在碱胁迫下观察到。这些结果进一步表明根作为野生大豆Na⁺积累主要部位。

3.3 盐碱胁迫下野生大豆富集基因

由于根是主要Na⁺储存器官，转录组测序在盐、碱和对照条件下根样品进行。总共生成499,356,810清洁读段（73.38 Gb）。Q30分数超过93.00%，GC含量平均~44.00%。超过92.00%清洁读段唯一比对G. soja参考基因组。本论文报告的原始序列数据已存入国家基因组数据中心（中国国家生物信息中心/中国科学院北京基因组研究所）的基因组序列存档（GSA: CRA028818），公开可访问。最终，每样品约42,000个unigenes识别，产生总共55,539个非冗余unigenes。其中，55,534在至少一个数据库，NR数据库显示最高注释率（55,531）。主成分分析（PCA）显示所有样品清晰转录组分离。碱胁迫处理样品聚类更接近对照相较于盐胁迫，而1.2% NaCl处理明显分离所有其他样品，表明响应更大差异。

DEGs在六个比较组识别。组A由盐处理和对照间比较组成，CK对0.6% NaCl（组A1），1.2% NaCl（组A2），和1.2% NaCl对0.6% NaCl（组A3）。而组B比较碱胁迫（pH 9.16）对CK（组B1），0.6% NaCl（组B2），和1.2% NaCl（组B3）。组A2有最高DEGs数（5,228），含1,956上调和3,272下调DEGs。组B3随后有3,516 DEGs，包括1,427上调和2,089下调。这些结果表明高盐胁迫（1.2% NaCl）强烈改变野生大豆基因表达。

3.4 层次聚类获得DEGs簇

总共7,355个非冗余DEGs在所有比较组识别。层次聚类分类这些DEGs为五个 distinct表达簇。簇I和IV在盐胁迫下下调相较于对照和碱胁迫。GO富集显示簇I富集于“脂质代谢过程”和簇IV在“质膜”。相反，簇III中DEGs在盐胁迫下上调相对于对照。富集GO术语包括“半乳糖基转移酶活性”、“跨膜转运蛋白活性”和“转运蛋白活性”，表明跨膜转运蛋白和抗氧化相关酶参与盐胁迫适应。簇II显示在盐和碱胁迫下下调相较于对照，“细胞壁组织”作为最富集术语。簇V显示在1.2% NaCl处理下独占且显著升高表达，在0.6% NaCl和碱胁迫处理下观察到次要响应。总之，簇IV中DEGs在碱胁迫下独占上调但在盐胁迫下调，而簇I和III中DEGs在盐胁迫下特异性差异表达。因此，簇I、III和IV选择用于进一步分析和下游调查。

3.5 盐碱胁迫下代谢通路富集DEGs

GO富集分析显示簇I和IV中DEGs表现相似表达模式，而簇III中DEGs在盐胁迫处理下显示 distinct表达谱。簇IV中DEGs在碱胁迫处理下上调。簇I（特异性盐胁迫下下调）和簇IV（盐胁迫下下调且碱胁迫下上调）的KEGG揭示与类黄酮代谢相关通路，包括“苯丙烷生物合成”和“类黄酮生物合成”。簇III（盐胁迫下上调）的KEGG富集于通路包括“半乳糖代谢”、“植物激素信号转导”和“ABC转运蛋白”。

3.6 苯丙烷和类黄酮生物合成基因差异表达

为进一步阐明差异代谢响应，我们分析苯丙烷和类黄酮生物合成通路内结构基因表达变化。碱胁迫下，一个苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因和30个过氧化物酶基因特异性上调。此外，碱胁迫下，13个查尔酮合成酶（CHS）基因和5个查尔酮异构酶（CHI）基因观察到更高表达。另外，一个UDP-糖基转移酶79B1（UGT79B1）和一个类黄酮3’-单加氧酶（CYP75B1）独占此处理下调控。相反，两个黄酮合成酶（FLS）基因和类黄酮3’,5’-羟化酶（F3’5’H）特异性盐胁迫下诱导。这些结果表明类黄酮可能在野生大豆碱胁迫适应中扮演更关键角色。

3.7 盐碱胁迫下钠转运相关调控网络

本研究中，我们识别29个与Na⁺流入和储存相关DEGs，大多数在盐胁迫下上调，尤其在1.2% NaCl对CK比较组。此差异表达与观察Na⁺积累水平相关。值得注意的是，Glysoja.03G007427（编码钠转运蛋白HKT1）和Glysoja.15G041067（编码钾转运蛋白KT11）特异性盐胁迫下上调。相反，Glysoja.20G054400和Glysoja.10G027804（编码水通道蛋白NIP5-1）响应特异性碱胁迫。

此外，总共385个转录因子（TF）编码DEGs识别，主要来自MYB（19%）、ERF（17%）、bHLH（17%）和WRKY（14%）家族，共占所有TFs的67%。共表达网络分析揭示盐胁迫下比碱胁迫更复杂TF-基因调控互作。盐响应TFs包括Glysoja.11G029929、Glysoja.11G029815和Glysoja.20G054770，而碱响应TFs包括Glysoja.06G015139、Glysoja.09G024775和Glysoja.16G042505。关键Na⁺转运蛋白基因盐胁迫下响应包括Glysoja.08G019327、Glysoja.15G041067和Glysoja.09G025101，而Glysoja.10G027804、Glysoja.15G041045和Glysoja.15G041067与碱胁迫相关。

3.8 qRT-PCR验证

六个与类黄酮生物合成或Na⁺流入和储存相关DEGs随机选择用于qRT-PCR分析，使用Primer Premier 5.0设计特异性引物，以确定暴露于盐（0.6% NaCl和1.2% NaCl）和碱（pH 9.16）胁迫处理后mRNA水平。结果显示qRT-PCR相对基因表达趋势与RNA-seq一致，证明RNA-seq数据可靠性。

3.9 类黄酮补充改善盐碱胁迫耐受性

为进一步验证类黄酮功能相关性，进行外源芦丁和圣草酚应用。芦丁（一种黄酮醇苷）和圣草酚（一种核心黄烷酮）选择因其在类黄酮生物合成通路中的核心作用及其在胁迫响应中的参与。在1.2% NaCl和pH 9.16处理下，类黄酮补充显著增加株高。根长在0.6% NaCl胁迫下显著增强，而叶面积在所有类黄酮处理样品显示增加。总之，这些结果表明类黄酮可通过促进关键生长参数增强野生大豆盐碱胁迫耐受性。

4 讨论

盐碱胁迫通过扰乱离子平衡和诱导氧化应激显著阻碍植物生长。胁迫耐受植物中观察到的关键适应策略涉及 excess Na⁺在根组织中的区隔化，从而保护光合活性叶。本研究中，野生大豆种质在盐和碱胁迫下显示根中Na⁺积累显著高于地上部。Na⁺转运在碱胁迫下有限但在盐胁迫下更广泛，表明根基Na⁺区隔化作为关键解毒机制，尤其在高pH环境。转录组分析揭示盐胁迫主要上调Na⁺区隔化相关基因，而碱胁迫优先激活类黄酮生物合成通路，表明向抗氧化和pH缓冲响应转变。这些结果强调野生大豆中胁迫特异性策略，根局部离子保留和差异基因表达在耐盐碱性中扮演核心角色。

形态学观察显示，盐碱处理野生大豆表现抑制种子萌发和受损幼苗生长，碱胁迫下抑制更明显。这与渗透胁迫诱导生长限制一致如先前报告。尽管观察到株高略有减少，差异无统计学意义。这些结果表明碱胁迫对早期发育阶段施加更强抑制效应相较于盐胁迫，可能由于高pH和渗透失衡联合效应。

盐胁迫下离子分析显示从根到叶Na⁺逐渐增加，根显示最高积累。碱胁迫下，Na⁺ largely confined to roots。K⁺主要富集于茎在所有盐处理，其次碱胁迫。K⁺/Na⁺比率在盐胁迫下显著下降，尤其在根。相反，碱胁迫维持K⁺/Na⁺比率接近对照水平，茎显示最高缓冲能力。此组织特异性离子分配反映维持盐碱胁迫下离子稳态的关键机制，与先前在大豆和棉花中的报告一致，强调离子稳态在胁迫耐受中的重要性。此模式进一步得到生物富集（BF）和转运（TF）因子支持。BF值在所有处理根中最高，尤其高盐度下，表明有效根基Na⁺区隔化，趋势与先前在大豆和水稻中的研究一致。TF值在盐胁迫下茎中升高，反映活跃Na⁺转运，类似报告。相反，碱胁迫下，TF所有组织保持低位，表明受限离子流动性可能由于高pH诱导离子转运抑制。这些结果确认野生大豆依赖根离子保留和有限转运在碱性条件，而盐胁迫允许更大Na⁺流动性，反映响应不同胁迫类型的 distinct离子管理策略。

为进一步阐明野生大豆盐碱胁迫响应调控机制，进行根组织转录组分析。DEGs通过层次聚类分组为五个簇。簇I和IV显示在对照和碱胁迫条件下表达升高，显著富集于脂质代谢、细胞分解代谢过程和类黄酮生物合成通路。这表明向抗氧化防御和代谢调整转变以减轻高pH诱导氧化和结构应激。此类响应与先前证明类黄酮和脂质重塑在碱胁迫条件下保护作用的发现一致。类黄酮，通过苯丙烷通路合成，作为关键抗氧化剂和渗透应激响应调节剂。碱胁迫下，苯丙烷和类黄酮生物合成通路显著富集，涉及关键基因如PAL、4CL、COMT、CAD、UGT72E和POD，与木质素和类黄酮积累相关，贡献增强结构完整性和活性氧（ROS）清除。此响应反映植物在高pH条件下常见保护策略，如先前在大豆和水稻中报告。总之，这些发现强调次生代谢在增强野生大豆碱胁迫耐受性中的核心角色。相反，簇III特异性盐胁迫下上调，富集于植物激素信号转导和ABC转运蛋白通路，表明跨膜转运和激素介导调控在盐度适应中的活跃角色。这得到早先报告支持，强调ABC转运蛋白和激素串扰在耐盐机制中的参与。转录组分析还揭示离子转运相关基因上调，尤其Na⁺/H⁺ antiporters和高亲和力K⁺转运蛋白，支持其在大豆离子解毒和稳态中的既定角色。而簇I和IV富集于碱胁迫下次生代谢和氧化防御相关基因，簇III显示盐处理下离子转运蛋白 predominant表达，突出胁迫类型间转录分歧。这些发现表明野生大豆根协调 distinct分子响应，限制Na⁺流动性和增强ROS防御在碱胁迫下，和激活离子转运机制在盐度下。此胁迫特异性转录程序分配强调野生大豆对对比土壤条件的适应灵活性。

DEGs和TFs间共表达网络分析揭示盐胁迫下关键Na⁺转运和稳态相关基因显著上调。这些包括HKT1（Glysoja.01G000023）、Na⁺/H⁺ antiporters和H⁺-ATPases，促进胞质Na⁺排斥和液泡区隔化，减轻离子毒性的必需机制。盐胁迫增强跨膜电化学梯度，促进Na⁺通过非选择性阳离子通道（NSCCs）、环核苷酸门控通道（CNGCs）、谷氨酸受体（GLRs）和高亲和力K⁺转运蛋白（HKTs）流入根细胞。Excess Na⁺扰乱离子稳态，触发响应以维持Na⁺/K⁺比率。HKT1转运蛋白在调控长距离Na⁺转运和限制根向地上部转运中扮演核心角色。蓝莓植物中VcHKT1;1转录水平降低导致木质部汁液中Na⁺浓度增加和更高叶Na⁺含量相较于野生型植物，表明VcHKT1;1通过从木质部汁液回收Na⁺促进叶Na⁺排斥。除木质部Na⁺卸载外，ScHKT1;2报告参与Na⁺装载入韧皮部，促进番茄中从地上部向根Na⁺再循环。本研究中盐特异性HKT1上调表明其参与野生大豆根局部Na⁺保留。富集于MYB、ERF、bHLH和WRKY家族的TFs与盐胁迫下Na