综述：解码先天性心脏病：心脏谱系与调控功能障碍的多组学框架

本综述系统整合了单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组学及多组学技术的最新进展，深入解析了先天性心脏病（CHD）的发育起源。文章重点阐述了第一和第二心野（FHF/SHF）、心脏神经嵴细胞（CNC）等关键祖细胞谱系的命运决定机制，揭示了Wnt、Hippo、Notch等信号通路在心脏形态发生中的核心作用，并探讨了多组学整合如何将非编码风险变异映射至精确的时空细胞状态，为CHD的精准诊断、靶向预防和再生治疗提供了全新框架。

　　

1 引言

先天性心脏病（CHD）是全球最常见的出生缺陷，源于心脏谱系规范和形态发生过程中高度调控的程序被破坏。其病因具有高度异质性，约三分之一病例由染色体异常（如21三体、22q11.2微缺失）或关键转录因子（如NKX2-5、GATA4、TBX5）和信号基因（如NOTCH1、JAG1）的致病性变异引起。然而，全外显子和全基因组关联研究（GWAS）表明，大多数风险是多基因性的，受上位效应、不完全外显率和基因-环境协同作用调控。母体糖尿病、缺氧、致畸药物暴露和微量营养素缺乏等环境因素，均可加剧或暴露遗传易感性。

传统模型因分辨率和时间映射不足而受限。单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组学和整合多组学的进展，通过对畸形背后的细胞起源和调控景观进行高分辨率分析，彻底改变了我们对CHD的理解。

2 心脏蓝图：心脏祖细胞谱系及其分子逻辑

心脏形成由离散的祖细胞谱系和精确调控的分子信号共同支配。

2.1 心脏祖细胞的出现：从中胚层到心野

心脏发育始于原肠胚形成后不久，多能中胚层细胞被特化为生心祖细胞。转录因子Mesp1是中胚层中表达的核心调控因子，作为心血管谱系承诺的主开关。单细胞谱系追踪和转录组分析显示，这些祖细胞具有异质性并预模式化为不同命运。Notch1信号标记了最早的心内膜谱系分离：一部分原肠胚形成时的Mesp1⁺祖细胞表达Notch1，命运映射显示这些细胞主要定植于成熟心脏的心内膜。

原肠胚形成期间，心脏祖细胞迁移至胚胎前部形成新月形的心脏新月。该结构由至少两个主要、时空不同的祖细胞池组成：第一心野（FHF）和第二心野（SHF）。FHF最先分化，向内折叠形成原始线性心管，命运主要成为左心室（LV）并贡献于两个心房，分子上由Tbx5和Hand1等关键转录因子表达定义。SHF是位于正在分化的FHF内侧的内脏中胚层中的多能祖细胞群，保持低分化、增殖状态，并逐步添加到延长心管的动脉（流出）和静脉（流入）极，负责心脏的显著生长和重塑，产生右心室（RV）、整个流出道（OFT）（之后分隔为主动脉和肺动脉）和心房的重要部分，其分子标志是LIM同源域转录因子Isl1。

FHF和SHF贡献的时序和层级性质为不同类别CHD的起源提供了清晰的发育逻辑。FHF建立初始心管和LV，而SHF驱动后续扩张和复杂性增加以形成RV和大动脉。这种时间区分意味着发生在不同时间点的发育扰动会影响不同的心脏结构。

超越经典观点，单细胞分析表明这些“心野”最初是生心中胚层的连续体，而非严格分离的谱系。命运映射研究显示，在原肠胚形成/早期器官发生时，FHF和SHF细胞作为侧中胚层的连续群体混合，仅在后来分化为不同的解剖贡献。视黄酸（RA）信号沿心脏前后轴模式化这些祖细胞。通过调节人多能干细胞（hPSC）培养物中的RA水平，研究人员可以将分化细胞偏向FHF样或SHF样身份。这种可塑性在体外进一步得到证实，多能祖细胞可通过RA或Wnt信号重新指定以改变其命运。

2.2 分子驱动者：基因调控网络和关键转录因子

心脏谱系的规范和形态发生由内在基因调控网络（GRN）和外在信号通路的复杂相互作用协调。核心转录因子网络包括NKX2-5、GATA4和TBX5，对启动和维持心脏程序至关重要。

NKX2-5是心脏祖细胞中最早表达的标志物之一，被认为是心脏发育的主调控因子，对祖细胞增殖、心管环化和心室基因表达程序的建立是必需的。小鼠中Nkx2.5缺失导致心脏停止、未环化和早期胚胎致死。在人类中，NKX2-5杂合突变是家族性CHD的重要原因，最常见表现为房间隔缺损（ASD）和房室传导异常。

GATA4和TBX5是NKX2-5的关键伙伴，在 downstream 心脏基因的启动子上物理相互作用，协同激活其表达以驱动心肌细胞分化。这种组合作用是心脏GRN的基石。GATA4突变与各种间隔缺损相关，而TBX5突变导致Holt-Oram综合征，其特征是上肢畸形和最显著的ASD。

虽然FHF严重依赖NKX2-5/GATA4/TBX5轴，但SHF受一个不同但重叠的GRN支配。SHF的关键调控因子是ISL1，对维持SHF祖细胞池处于增殖和多能状态至关重要，部分通过激活Mef2c和Hand2等下游靶标实现。除了增殖，ISL1是SHF内细胞命运的关键决定因素，促进心室特性同时 actively 抑制由RA信号驱动的房性命运程序。

2.3 外在信号：Wnt、BMP、FGF、Notch和Hedgehog通路

内在GRN不断受到来自周围组织的外在信号调节。

Wnt信号通路在心脏发生中扮演着著名的双重和上下文依赖角色。经典Wnt/β-catenin信号最初活跃以将中胚层细胞特化为心脏命运，但随后必须被 actively 抑制以允许这些祖细胞分化为心肌细胞。该通路后来在SHF内被重新激活，对驱动Isl1+祖细胞的增殖至关重要。同时，非经典Wnt通路（例如通过Wnt11）是活跃的，通常促进生心分化和形态发生。Wnt信号的这种精确时间调制充当主开关，控制祖细胞特化、分化和扩张的时间。

骨形态发生蛋白（BMP）和FGF信号是心脏发生的主要诱导者，从前肠内胚层发出以模式化上覆的中胚层。这两条通路通常具有相反但协调的效果。通常，FGF信号维持心脏祖细胞处于增殖、未分化状态，防止其过早分化。相反，BMP信号通常促进分化为心肌细胞。这种拮抗作用的一个关键例子发生在SHF，其中来自周围组织的特定信号如BMP4通过直接抑制SHF祖细胞内的FGF-ERK信号级联来促进心肌细胞分化。这种动态拮抗确保了一个祖细胞池被维持，而其他祖细胞逐步被部署到生长的心脏。

Notch信号作为细胞间通讯的关键通路，对相邻细胞间的细胞命运决定至关重要。其在心脏中最明确的作用是在瓣膜发生中。Notch信号在房室管和OFT的心内膜细胞中是必需的，以启动内皮-间质转化（EMT），这是一个内皮细胞转化为迁移性间充质细胞的过程，这些细胞定植并形成原始瓣膜垫。随后，Notch继续调节这些垫重塑为成熟、薄的瓣膜小叶。这一作用的临床意义深远：NOTCH1突变是二叶式主动脉瓣（BAV）最常见的单基因原因，影响约1%的人群，并强烈 predispose 个体在晚年发生钙化性主动脉瓣疾病。Notch对心室小梁形成和心肌致密化过程也至关重要，确保形成厚实、功能性的心室壁。

除了这些经典通路，新出现的证据突出了Hippo–Yes相关蛋白（YAP）和Hedgehog信号级联的不可或缺的作用。Hippo–YAP通路通过控制胚胎发生期间的心肌细胞增殖作为关键的器官大小调节器。在胎儿心脏中，心肌细胞核中活跃的YAP促进细胞周期活动和心肌生长，而Hippo激酶激活则抑制过度增殖。这一范式在小鼠模型中得到清晰证明：删除Hippo通路组分导致不受控制的心肌细胞增殖和心脏肥大（心脏扩大），而相反，心肌细胞特异性YAP缺失导致致命的心脏发育不全伴心室壁异常薄。因此，YAP活性不足可能是心脏发育不全（如左心发育不全综合征）的基础，使得平衡的Hippo–YAP信号对于实现适当的心脏腔室大小至关重要。

同时，Hedgehog信号已成为模式化胚胎流出道的关键通路。从咽内胚层分泌的Sonic hedgehog（Shh）为SHF祖细胞和心脏神经嵴细胞（CNCC）提供必需的营养信号。这是一个跨谱系通讯的经典例子，其中源自1种细胞类型（内胚层衍生的咽组织）的信号被要求指导其他、不同细胞群体（中胚层衍生的SHF和外胚层衍生的CNCC）的行为。机制上，Hedgehog信号对于维持SHF祖细胞的增殖和支持CNCC存活是必要的。当Shh信号缺失或被阻断时，胚胎表现出一系列严重的圆锥动脉干缺陷，模仿法洛四联症和永存动脉干。此外，Hedgehog活动影响流入道和间隔发育；其 disruption 也与房间隔缺损和房室垫缺陷有关。总之，这两条通路的 disruption 可直接表现为CHD表型，如发育不全腔室（Hippo–YAP功能丧失）和一系列圆锥动脉干和分隔异常（Hedgehog不足）。

2.4 生物物理线索：机械力和左右模式化

除了可溶性形态发生素，内在基因调控网络也深受物理力的影响。跳动胚胎心脏产生的血流动力对于早期心脏形态发生至关重要，特别是在驱动瓣膜形成中。当心脏开始跳动时，内皮细胞使用纤毛和机械敏感离子通道等关键结构感知剪切应力和流体流动。这种机械转导级联开始于心内膜细胞感知血流诱导的剪切应力，这是一个由Piezo1离子通道等机械敏感结构介导的过程。这些通道被物理力激活触发关键转录因子KLF2的上调。KLF2然后作为 central 下游效应器，直接激活Notch通路。这一最终步骤对于促使形成原始瓣膜垫的内皮-间质转化（EMT）至关重要。这为瓣膜发生建立了一个清晰的信号序列：血流 → Piezo1激活 → KLF2表达 → Notch激活。因此，失去这些机械感觉输入直接导致先天性瓣膜缺陷。斑马鱼研究表明，突变多个流动传感器（例如Pkd2、Trpv4、Piezo1/2）损害房室瓣延长，而实验诱导的异常心内流动产生更严重的瓣膜畸形。这些发现表明，冗余的机械信号通路汇聚于Klf2/Notch轴以支配瓣膜发育，其中Piezo1等机械传感器作为剪切应力下内皮基因表达的 central 调节器。

机械力同样对腔室形态发生和左右模式化的建立不可或缺。胚胎左右组织者使用运动纤毛产生定向流体流动，打破对称性并指导心脏和内脏的偏侧性。破坏这种纤毛驱动的流动，如在原发性纤毛运动障碍中所见，随机化左右模式化并 often 导致异位综合征，这与复杂的先天性心脏缺陷相关。在缺乏运动节点纤毛的小鼠中，心管无法正确环化，导致流出道错位和分隔异常。

值得注意的是，心内膜细胞带有初级纤毛，可以直接感知心内流体力，将剪切应力信号传递至细胞核，并在高流动区域激活Klf2和Notch。干扰这种机械感觉，例如在纤毛基因突变体中，产生一系列CHD表型，包括房室间隔缺损、瓣膜发育不良和心肌壁变薄。总之，生物力学线索——从设置左右轴的纤毛驱动流动到调节心内膜基因程序的壁剪切应力——是正常心脏发育不可或缺的指挥者，它们的 disruption 代表了先天性心脏缺陷的根本致病机制。证据还指出纤毛信号（建立左右不对称）至关重要：纤毛缺陷（例如在异位综合征中）导致左右模式化基因的错误表达和复杂的CHD，包括间隔缺损和大动脉转位。

2.5 心脏神经嵴：关键的迁移群体

心脏并非纯粹的中胚层器官；其正常发育 critically 依赖于外胚层衍生的心脏神经嵴（CNC）细胞的贡献。这些是从背神经管 delaminate 的短暂、高度迁移和多能细胞群体，穿过咽弓，并定植于发育中的心脏流出道。

CNC对于OFT的正确模式化和分隔是不可或缺的。CNC细胞分化为大动脉的平滑肌，并形成 within 干和锥垫的大部分间充质，这些垫融合创建主肺动脉隔，将共同OFT分为体循环主动脉和肺动脉。因此，实验性切除或 genetic disruption of CNC development 导致一系列严重的圆锥动脉干缺陷，包括永存动脉干（OFT分隔完全失败）和主动脉弓动脉异常。

因此，OFT的发育是一个相互依赖的过程，需要中胚层衍生的SHF和外胚层衍生的CNC之间复杂的信号和物理相互作用。SHF提供OFT的心肌壁，创建结构 scaffold，而CNC orchestrate 其内部分隔和模式化。这种“OFT发育模块”的概念解释了为什么一个谱系的缺陷可以模仿另一个谱系的缺陷。例如，原发性SHF缺陷可能导致无法为CNC迁移和分隔提供正确的信号线索，而原发性CNC缺陷使正确形成的心肌管未被分隔。这种相互作用以基因为例，如TBX1，一个在CNC中不表达的SHF调节器，其突变 nonetheless 由于SHF-to-CNC信号 disruption 导致模仿原发性CNC疾病的缺陷。

2.6 近心野和心外膜起源

经典的FHF/SHF/CNC模型不断被新发现 refined，这些发现揭示了额外的祖细胞群体和惊人的可塑性程度。例如，单细胞图谱和命运映射实验发现了一个新的祖细胞群体，称为JCF，位于心脏新月体的吻侧边界。最初以Mab21l2等标志物的表达为特征，同时缺乏核心心脏标志物Nkx2.5，JCF似乎是心肌细胞和心外膜（心脏的外层）的共同祖细胞池。这一发现挑战了心外膜 exclusively 起源于一个 distinct 结构的长期观点，并表明心肌和心外膜谱系有共享起源。

2.7 新兴的谱系可塑性和冗余

新兴的谱系追踪数据也揭示了心脏细胞类型的新来源。一个 striking 的例子是心脏神经嵴细胞（cNCCs）对心肌细胞的贡献。此前，神经嵴被认为 only 形成心脏中的非肌肉组织，但最近的命运映射显示，一个cNCCs亚群在多个物种中分化为真正的心肌细胞。这些cNCC衍生的心肌细胞整合在发育中和再生的心脏中，并且是斑马鱼损伤后 proper 再生所必需的。类似地，心外膜 harbors 具有惊人效力的祖细胞。虽然哺乳动物心外膜向心肌细胞的转化仍在争论中，但蝾螈心脏损伤模型和心脏类器官的研究暗示，在特定线索下，心外膜细胞可以获得比 once appreciated 更广泛的命运。

最后，早期心脏似乎部署了谱系冗余和补偿。如果一个群体受损，其他群体有时可以填补空缺。例如，在斑马鱼胚胎心脏中，心室肌肉被实验性切除，一些心房心肌细胞可以重编程并转化为心室肌肉，部分再生缺失的腔室。这种可塑性 exemplify 了当需要时细胞命运转换的发育能力。总之，心管形成时期涉及动态的短暂祖细胞群体和跨谱系可塑性，这比先前认识到的更大。这种灵活性提供了对抗发育扰动的缓冲，但如果 misregulated，也可能成为病理的来源。理解这些新的谱系关系丰富了我们对心脏发生的看法，提供了关于胚胎心脏如何有时从扰动中“拯救”自己的线索，以及为什么其未能这样做可能导致先天性缺陷。

2.8 心脏谱系承诺中的表观遗传和转录后调控

除了遗传和基于信号的调控，心脏谱系承诺也由表观遗传和转录后机制支配，这些机制以高精度微调基因表达。表观遗传调控因子在心脏发育中日益被认可；例如，组蛋白修饰酶和染色质重塑器（如CHD7，在CHARGE综合征中突变）可以影响心脏嵴和SHF基因表达，导致流出道缺陷。核心转录因子和信号通路的活动被其他调控层进一步 refined，包括非编码RNA。

长链非编码RNA（lncRNA）：这些多功能分子可以通过各种机制调节基因表达，包括作为蛋白质复合物的支架或其他分子的诱饵。一个引人注目的例子是人特异性lncRNA HBL1（心脏制动LncRNA 1），它作为心肌细胞分化的关键负调控因子。在细胞质中，HBL1作为microRNA-1（miR-1）的“海绵”，将其隔离。在细胞核中，HBL1作为向导，招募抑制性Polycomb抑制复合物2（PRC2）到关键生心基因位点以沉默其表达。这种双区室机制提供了对心脏程序的复杂制动，必须释放该制动才能进行分化。

MicroRNA（miRNA）：这些小的非编码RNA是强大的转录后抑制因子，微调整个基因网络的表达。它们与心脏发育和疾病的几乎所有方面都有关。例如，miR-130已被证明在早期心肌发生期间调节BMP和FGF信号的平衡，展示了信号通路和转录后调控因子之间的 intricate 交叉对话。lncRNA和miRNA之间的相互作用，如HBL1海绵机制所见，为心脏GRN增加了另一层复杂性。

3 从谱系到病变：CHD的发育机制

心脏祖细胞部署、分子信号或谱系间通讯的 disruption 可以使正常心脏形态发生偏离轨道。

3.1 SHF和圆锥动脉干缺陷： disrupted 部署和分隔

第二心野是CHD的发育热点，因其对右心室、流出道和心脏间隔的广泛贡献。SHF祖细胞增殖、迁移或分化的扰动是圆锥动脉干缺陷的主要原因，这些缺陷占严重CHD的很大一部分。

一个典型的例子是转录因子TBX1在22q11.2缺失综合征（也称为DiGeorge综合征）中的作用。TBX1的单倍体不足是该综合征中心血管异常的主要驱动因素。Tbx1对于维持SHF祖细胞的增殖至关重要。在其缺失的情况下，SHF发育不全（hypoplastic），导致缩短和畸形的OFT。SHF部署的这种原发性缺陷临床表现为严重的圆锥动脉干畸形，包括永存动脉干、法洛四联症和主动脉弓中断。此外，详细分析显示，Tbx1缺失不成比例地影响肺动脉下心肌（未来肺动脉的基部）的发育。这不仅导致OFT错位，而且引起异常冠状动脉模式化，揭示了SHF心肌与冠状动脉口正确定位之间意想不到的发育联系。然而，SHF发育并非孤立发生。其与迁移的CNC的相互作用形成了一个功能发育模块，对分隔和弓模式化至关重要。

3.2 CNC–SHF轴和咽信号缺陷

正确分隔的流出道和主动脉弓系统的形成依赖于SHF中胚层和迁移的心脏神经嵴细胞之间 tightly 调控的对话。这种通讯的 disruptions 是CHD的主要原因。Tbx1的故事再次提供了一个关键例子。Tbx1在SHF和周围咽组织中表达，但不在CNC themselves 中表达。然而，Tbx1缺失严重破坏了CNC依赖的结构。发生这种情况是因为Tbx1调节咽环境内信号分子的表达，这些分子是引导CNC迁移和支持其存活所必需的。这些信号包括FGF（例如FGF8）和Slit/Robo家族的成员。

这种关系是互惠的。动物模型中CNC的实验性切除导致SHF部署的继发性缺陷，其特征是添加到OFT的心肌减少。这种继发性效应似乎是由咽中FGF8信号 resulting 失调介导的。这突显了“心脏颅面发育模块”的概念，其中SHF和CNC在功能上如此交织，以至于一个谱系的原发性缺陷 inevitably 导致另一个谱系的继发性 failure，最终导致共享的复杂圆锥动脉干和主动脉弓缺陷谱。

虽然遗传相互作用主导大多数CHD范式，但环境损害——特别是母体代谢紊乱——可以汇聚在相同的发育轴上。

3.3 基因-环境相互作用：母体糖尿病作为模型

虽然遗传因素 paramount，但发育关键窗口期间的环境暴露也可能导致CHD，通常通过影响相同的核心发育通路。母体孕前糖尿病是一个 well-established 致畸剂，使后代患CHD的风险增加三到五倍。相关缺陷 frequently 涉及心脏流出道和间隔，指向SHF和CNC发育的 disruption。

高血糖是主要的致畸剂，最近的研究发现了将高血糖水平与心脏缺陷联系起来的精确分子级联。这项研究为理解基因-环境相互作用提供了一个强大的模型。该级联开始于高血糖诱导氧化应激并改变发育中心脏细胞的表观基因组。具体而言，高葡萄糖已被证明降低Nos3（编码内皮一氧化氮合酶的基因）启动子处的染色质可及性。这种表观遗传沉默导致一氧化氮（NO）产生减少，NO是一种关键的信号分子。NO的减少进而导致Jarid2（一种转录抑制因子）的上调。JARID2然后直接结合到Notch1基因位点，招募抑制性组蛋白标记以沉默Notch1表达。

这种机制优雅地展示了环境应激源（高血糖）如何触发特定的表观遗传和转录级联，最终下调心脏发育的主调控因子（Notch1）。这种效应在可能已有遗传 predispose 的个体中尤其有害，例如NOTCH1杂合突变（单倍体不足）。在这些情况下，环境应激将Notch信号推至关键功能阈值以下，导致严重的心脏缺陷。该模型为遗传和环境因素如何汇聚导致CHD提供了清晰、机制性的解释。

4 将基因型与细胞表型联系起来：CHD发病机制的多组学剖析

CHD源于心脏发育的复杂 disruptions，但其潜在机制 often 难以解析， due to 时间、空间和细胞类型特异性因素的相互作用。随着单细胞和空间组学技术的出现，研究人员现在拥有以前所未有的分辨率剖析这些复杂过程的工具。

4.1 现代工具包：以单细胞分辨率 charting 发育

现代单细胞和空间技术通过解决三个基本问题彻底改变了发育生物学：“存在什么细胞类型？”、“它们位于何处？”和“什么调控程序定义了它们的命运？”

ScRNA-seq能够对数千个单个细胞中的转录状态进行无偏 profiling，揭示了整个胚胎发生过程中心脏细胞类型的多样化和动态景观。这些数据已被用于生成小鼠和人类模型胎儿心脏的全面细胞图谱，通过伪时间和RNA velocity 算法促进谱系追踪和发育轨迹重建。同时，单细胞转座酶可及染色质测定（scATAC-seq）在单细胞水平映射染色质可及性，揭示了支配细胞身份和状态转换的增强子和启动子的时间激活。

空间转录组学（ST）通过Visium和MERFISH等平台，通过直接在完整组织切片内测量基因表达 reintroduces 组织 context， enabling 细胞类型定位和三维邻域映射。当 combined 时，这些技术创建了心脏发育的统一、多维视图， allowing 研究人员推断信号通路、转录层级和空间细胞-细胞相互作用——这些元素对于理解遗传改变如何 disrupt 正常形态发生至关重要。

4.2 在单基因CHD模型中 pinpointing 细胞缺陷

对于单基因形式的CHD，其中 specific 突变已被识别，单细胞技术提供了 pinpoint 基因 dysfunction 引起的 precise 细胞和发育 disruptions 的强大手段。

例如，在Hand2敲除小鼠胚胎中，使用scRNA-seq揭示了流出道心肌祖细胞的选择性丢失，识别了前SHF谱系特化的关键 failure。这些祖细胞的丢失，传统方法无法检测，解释了OFT表型的 truncation。此外，失调的视黄酸（RA）信号被揭示为一个主要贡献因素，提供了Hand2缺失下游模式化缺陷的机制 insight。

类似地，Pitx2缺失小鼠胚胎的单细胞 profiling 揭示了前和后SHF群体中 altered 分化轨迹，阐明了左右不对称缺陷如何转化为 specific 心脏畸形。空间转录组学也通过揭示心肌细胞中空间 restricted 增殖缺陷（没有解剖 context 将不可见）澄清了细微表型，例如Nfya缺陷模型中的致密心肌变薄。

这些研究 exemplify 单细胞和空间工具如何揭示单基因CHD模型中的谱系特异性脆弱性，追踪从基因突变到 disrupted 形态发生的因果链。

4.3 解卷积多基因风险：将非编码变异映射到细胞类型特异性增强子

虽然单基因突变提供了易于处理的切入点，但大多数CHD病例是多基因性的，许多通过全基因组关联研究（GWAS）识别的风险位点位于基因组的非编码区域。破译这些变异的功能—— often 标记为“暗物质”——需要将它们与在相关细胞类型和发育窗口中活跃的特定增强子联系起来。

scATAC-seq提供了将增强子活性分配给单个心脏谱系所需的分辨率，跨祖细胞群体映射开放染色质区域。例如，关键心脏转录因子如NKX2-5、MEF2和GATA4的 motif 在FHF和SHF衍生物特异性可及染色质中富集。当这些区域与CHD相关变异相交时，研究人员可以假设哪些变异可能 disrupt 增强子功能以及在哪种细胞类型中。

最近的多组学研究进一步整合了来自同一细胞的染色质可及性和转录输出， allowing 构建细胞类型特异性基因调控网络（GRN）。在一个案例中，发现一个非编码变异 disrupt 了一个在心室心肌细胞中活跃的GATA4结合增强子，并且基于CRISPR的报告分析在体外 confirmed 其功能丧失，将该变异直接与室间隔缺损联系起来。

因此，源自scATAC-seq和多组学数据的以增强子为中心的地图提供了新的视角来解释非编码GWAS发现， enabling 功能注释和细胞类型特异性疾病建模。

4.4 在组织 context 中重建信号微环境

CHD并非 solely 细胞自主现象——它产生于由细胞间通讯塑造的信号微环境中。空间组学技术独特地 enable 这些局部信号景观的重建。

ST数据揭示了形态发生素梯度和通路特异性激活区，这些对心脏模式化至关重要。例如，FGF8表达在OFT中空间 restricted，而Notch通路组分在瓣膜内衬的心内膜细胞中富集。这些梯度和区室在解离的单细胞数据中不可见，但在空间 context 中映射时变得明显。

应用于空间转录组学的配体-受体分析允许推断通讯枢纽。例如，显示房室心内膜细胞分泌影响瓣膜形成期间相邻间充质的因子，突出了形态发生中的关键细胞间轴。此外，空间蛋白质组学技术如CODEX和成像质谱流式 now allow 对这些相互作用进行原位多重蛋白质水平验证。这种心脏信号拓扑的重建不仅解释了局部 disruptions 如何导致全局缺陷，而且识别了CHD治疗干预的潜在旁分泌靶点。

4.5 空间分辨多组学：将遗传风险与时空脆弱性联系起来

scRNA-seq、scATAC-seq和ST的综合代表了CHD研究的范式转变，将静态基因列表转变为动态时空风险地图。

Asp等人的一项里程碑研究产生了人类胎儿心脏的第一个空间分辨转录组图谱，将scRNA-seq数据叠加到解剖切片上以映射祖细胞生态位和发育轨迹。Farah等人通过使用MERFISH分析超过140,000个胎儿心脏细胞扩展了这一点，识别了75种不同的细胞