胡芦巴组织特异性生物合成机制解析：多组学揭示生物碱、黄酮和萜类代谢调控网络

本研究通过整合代谢组学（UPLC-MS/MS）和转录组学（SMRT+RNA-seq）技术，系统解析了胡芦巴根、茎、叶中生物碱、黄酮类和萜类化合物的组织特异性积累模式，发现根部是次生代谢物合成关键部位，鉴定出CYP450s、CHS等关键基因，揭示了ABC转运蛋白和MYB/bHLH转录因子在代谢物转运与调控中的核心作用，为药用植物育种提供分子资源。

　　

引言

胡芦巴（Trigonella foenum-graecum L.）是一种兼具药用和食用价值的豆科植物，富含多种具有治疗潜力的生物活性化合物。然而，这些化合物在组织中的特异性分布及其生物合成途径尚未得到充分解析。本研究采用整合多组学策略，旨在阐明胡芦巴中生物碱、黄酮类和萜类化合物的组织特异性调控网络，识别关键转运蛋白和转录因子，并建立基因型-代谢型关联，为靶向生物工程提供基础。

材料与方法

研究使用来自中国甘肃省兰州的胡芦巴种子，在受控环境中生长一个月后，采集根、茎和叶组织进行转录组和代谢组分析。代谢组学采用UPLC-MS/MS技术，共鉴定出2,124种代谢物。转录组学则通过全长转录组测序（SMRT）和RNA-seq分析，揭示组织特异性差异表达基因（DEGs）。数据整合分析包括O2PLS回归、共表达网络构建、分子对接验证以及qRT-PCR实验确认。

结果

3.1 胡芦巴代谢组分析及DAMs鉴定

代谢组PCA分析显示不同组织间存在显著差异。共鉴定出1,476种正离子模式和648种负离子模式代谢物，其中次生代谢物占46%，以萜类（163种）、黄酮类（107种）和固醇类（70种）为主。根、茎、叶分别检测到2,011、2,060和2,012种代谢物，其中1,878种为三组织共有。差异积累代谢物（DAMs）分析表明，根与叶比较（DL_vs_DR）差异最显著，达1,020个DAMs。KEGG富集分析显示，根部特有DAMs显著富集于氨基酸代谢、异黄酮和生物碱生物合成途径；茎部与甜菜碱合成及苯丙氨酸/色氨酸代谢相关；叶部则与黄酮/黄酮醇生物合成及精氨酸/脯氨酸代谢通路相关。具体而言，生物碱（如龙胆碱和阿玛碱）主要富集于根部，而黄酮类（如2’’-O-乙酰基芦丁）和萜类（如solavetivone）在茎和叶中含量较高。

3.2 胡芦巴全长转录组特征

通过SMRT测序获得37.8 Gb数据，经自校正和去冗余后，得到203,123条全长非嵌合（FLNC）读长，平均长度1,696 bp，N50为1,900 bp。功能注释显示，93.71%的基因在NR数据库中得到注释。

3.3 胡芦巴转录组DEGs分析

转录组数据生成58.54 Gb高质量数据，Q30碱基百分比超过95.98%。共鉴定48,939个unigenes，N50为2,172 bp。PCA揭示组织间显著转录组变异。差异表达基因分析显示，根与茎比较（S_vs_R）有10,753个DEGs，根与叶（R_vs_L）有14,271个，茎与叶（S_vs_L）有7,762个。根部高表达基因富集于黄酮生物合成、萜类骨架生物合成、托烷/哌啶/吡啶生物碱生物合成、植物激素信号转导和ABC转运蛋白等通路；茎部与亚油酸代谢及角质、木栓质和蜡质生物合成相关；叶部则主要参与光合作用、氮代谢及糖代谢。这些结果提示根部是次生代谢物合成的主要场所，ABC转运蛋白可能在代谢物组织特异性分布中起关键作用。

3.4 转录组与代谢组整合分析

O2PLS回归显示基因与代谢物数据高度一致。针对黄酮、生物碱和萜类三大类次生代谢物，构建了共表达网络。黄酮生物合成中，18个CHS基因中仅All_1_transcript_6824在茎和叶中上调，其余在根中上调，与根中eriodictyol chalcone和eriodictyol积累一致。4个CHI基因在根中显著上调，可能导致liquiritigenin富集。叶中两个TfCYP75B1基因上调与taxifolin含量升高相关。茎和叶中两个FLS基因上调与山奈酚积累一致。根中多个基因（如7-IOMT、PTS、VR、IFR和HI4OMT）上调与prunetin、formononetin和(-)-medicarpin富集相关。

生物碱合成中，7个TfTR1呈现组织差异表达，其中All_1_transcript_81371在根中上调与东莨菪碱积累一致。4个DDC表达模式与根中多巴胺富集负相关。所有4个TfPAT在根中上调，16个AOC呈现组织差异表达。

萜类分析显示，二萜如GAs在叶中富集，与GA20ox和GA2ox表达负相关。根中demethylphylloquinol富集与TfMenA和NDC1表达负相关。茎和叶中monoterpenoids（如gentiopicroside和geniposidic acid）富集与MTD表达正相关。qRT-PCR验证了关键基因（TfCYP75B1、TfCHI、TfCHS、TfTR1、TfPAT和TfMenA）的组织特异性表达模式，与转录组数据高度一致。

3.5 DAMs与ABC转运蛋白的相关性及分子对接

ABC转运蛋白是植物次生代谢物转运的关键家族。研究鉴定出318个ABC转运蛋白基因，其中178个呈现组织特异性差异表达。共表达热图显示前20个ABC转运蛋白基因与代谢物（黄酮、生物碱和萜类）存在显著正或负相关。分子对接表明，TfABCG11（All_1_transcript_22649）与山奈酚形成5个氢键（Leu135、Gly184、Lys196、Asn392、Asp456），结合自由能为-8.1 kcal/mol；TfABCI17（All_1_transcript_69938）与阿玛碱形成2个氢键（Arg95、Thr165），结合自由能为-11.0 kcal/mol，提示这些转运蛋白可能直接参与代谢物的结合与转运。

3.6 DAMs与转录因子的相关性

共识别出1,287个转录因子（TFs），其中MYB、bHLH、WRKY、AP2/ERF、GRAS和C2C2家族显著富集。KEGG分析显示这些TFs富集于植物激素信号转导、MAPK信号通路、昼夜节律和植物-病原互作等通路。817个TFs呈现组织特异性表达，共表达网络分析提示潜在调控关系，如All_1_transcript_76288_MYB39、All_1_transcript_6318_NAC87和All_1_transcript_76489_NAC48可能调控hypaphorine、tabersonine和glycosminine的生物合成；All_1_transcript_76288_MYB39和All_1_transcript_71623_bHLH25可能调控vincamine合成。

讨论

4.1 胡芦巴组织特异性代谢分区

胡芦巴根、茎、叶代谢组存在显著差异，根部是生物碱、黄酮类和萜类化合物的主要储存场所，而叶和茎则富集特定黄酮和二萜。这种组织特异性分布模式与其他药用豆科植物（如葛根）相比，显示出进化上的代谢调控分歧。

4.2 从头转录组分析揭示生物合成驱动因子

全长转录组测序弥补了胡芦巴参考基因组缺失的不足。DEGs分析显示，根部高表达次生代谢物生物合成相关基因，如黄酮合成中的CHS、CHI和CYP75B1，生物碱合成中的TR，以及萜类合成中的MTD，与代谢物积累模式一致。这些发现为关键代谢物（如eriodictyol、东莨菪碱和gentiopicroside）的生物合成途径提供了新见解。

4.3 ABC转运蛋白在代谢物分区中的进化保守作用

ABC转运蛋白在植物次生代谢物组织特异性分布中起核心作用。本研究鉴定出大量组织特异性ABC转运蛋白基因，其与代谢物的显著相关性及分子对接结果支持它们参与代谢物转运，这与在青蒿、丹参和黄连等植物中的发现一致。

4.4 生物活性化合物合成的转录调控景观

MYB、bHLH等转录因子家族在次生代谢物调控中扮演重要角色。胡芦巴中鉴定到的TFs及其与代谢物的共表达关系，揭示了潜在的调控网络，为理解胡芦巴生物合成调控提供了新视角，与大豆、紫花苜蓿等豆科植物的调控机制具有保守性。

结论

本研究通过整合代谢组学和转录组学，揭示了胡芦巴幼苗组织中生物碱、黄酮类和萜类化合物的组织特异性积累模式，根部是主要合成场所。研究鉴定了关键酶编码基因、ABC转运蛋白及转录因子，为高效生产药用化合物提供了遗传资源，并支持药物应用的分子育种策略。