代谢组学分析揭示蓝果忍冬（Lonicera caerulea L.）苦味活性成分及其代谢通路

本研究通过感官评价、电子舌技术和非靶向代谢组学（UPLC-MS/MS）方法系统分析三个蓝果忍冬品种的苦味特征，鉴定出73种苦味代谢物，以黄酮类、氨基酸及其衍生物为主，发现氨基酸生物合成（ko01230）和类黄酮生物合成（ko00941）通路是品种间苦味差异的关键机制，为功能性苦味成分保留和风味品质优化提供科学依据。

　　

2 Materials and methods

2.1 Materials and chemicals

研究选取三种蓝果忍冬品种——Chaoxian（CX）、Luohuotan（LHT）和Lanjingling（LJL）作为实验材料。所有样品均在相同栽培条件下于中国黑龙江省哈尔滨市的实验果园中采集，果实形态存在显著差异：CX果实呈细长圆柱形（长约2.3 cm，宽约1.3 cm），LHT果实较短且呈椭圆形（长约1.5 cm，宽约0.9 cm），LJL果实长度中等（长约2.1 cm，宽约1.0 cm）且形态略扁。实验所用甲醇、乙腈和甲酸为色谱纯试剂，氯化钾和酒石酸为分析纯试剂。

2.2 Determination of the chemical constituents of blue honeysuckle samples

通过多种化学分析方法测定三种品种的基础理化指标：采用硝酸铝比色法测定总黄酮（TF）含量，以芦丁为标准物；采用苯酚-硫酸法测定总糖（TS）含量，以葡萄糖为标准；通过滴定法测定总酸（TA）含量，以苹果酸当量表示；采用Folin–Ciocalteu比色法测定总多酚（TP）含量，以没食子酸为标准。游离氨基酸分析采用氨基酸自动分析仪（A300）进行，样品经冷冻干燥、研磨提取后通过阳离子交换树脂柱分离检测。

2.3 Electronic tongue analysis

使用TS-5000Z电子舌系统分析三种蓝果忍冬的味觉特征。新鲜果汁经不同倍数稀释（酸味、苦味、涩味、鲜味和咸味分析稀释3倍，甜味分析稀释100倍）后进行测定，以30 mM氯化钾和0.3 mM酒石酸溶液作为参考液。

2.4 Sensory evaluation of bitter taste levels

由15名经过苦味识别培训的感官评价员（8女7男，25-45岁）采用9点结构化量表对三种品种的苦味强度进行评价（1表示“完全不苦”，9表示“极苦”），样品随机编码呈现，评价间隔用纯净水漱口。

2.5 Metabolomics analysis

2.5.1 Metabolome extraction

将冷冻干燥的蓝果忍冬粉末（100 mg）用70%甲醇溶液提取，经涡旋、离心和过滤后供UPLC-MS/MS分析。

2.5.2 UPLC-MS/MS analysis

采用UPLC（Nexera X2）-MS/MS（4,500 QTRAP）系统进行代谢物分析。色谱条件：Agilent SB-C18色谱柱（1.8 μm, 2.1 mm × 100 mm）；流动相A为含0.1%甲酸的超纯水，B为含0.1%甲酸的乙腈；梯度洗脱程序：0-9 min B相从5%升至95%，9-10 min保持95%，10-11.1 min降至5%，11.1-14 min保持5%；流速0.35 mL/min；柱温40°C；进样量4 μL。质谱条件：电喷雾离子化温度550°C，电压正模式5500 V/负模式-4500 V，帘气25 psi。代谢物鉴定基于自建数据库和BitterDB数据库，功能注释通过KEGG Compound数据库进行。

2.6 Data analysis

实验数据以三次平行实验的平均值±标准差表示，采用SPSS 22.0进行单因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比较检验（p < 0.05），使用Origin 2023进行主成分分析（PCA）和层次聚类分析。

3 Results and discussion

3.1 Chemical constituents of blue honeysuckle

三种品种的基础化学成分分析表明：CX的TF和TP含量最高（分别为2.46 ± 0.13 mg/g和3.15 ± 0.09 mg/g），LHT居中，LJL最低；CX和LHT的TS含量无显著差异（均为约85 mg/g），但显著高于LJL（76.23 mg/g）；LHT的TA含量最高（1.82%），显著高于CX（1.45%）和LJL（1.36%）。游离氨基酸分析显示，L-谷氨酰胺、L-谷氨酸和L-天冬氨酸占总游离氨基酸含量的80%以上，是鲜味的主要贡献者。CX中苦味相关氨基酸（L-精氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-苯丙氨酸）含量最高。

3.2 Electronic tongue analysis

电子舌分析表明：酸味是三个品种最突出的味觉指标，LHT酸度最高（响应值15.23），与TA测定结果一致；苦味和涩味存在品种间差异，CX的苦味（6.78）、后味苦味（Aftertaste-B, 4.56）和后味涩味（Aftertaste-A, 2.89）值最高，LHT居中，LJL最低。PCA分析显示PC1和PC2的方差贡献率分别为75.5%和20.5%，苦味在PC1上贡献最大，涩味-A和后味-B次之，表明这些味觉属性是品种间风味差异的主要来源。

3.3 Bitter taste levels evaluation of three varieties of blue honeysuckle

感官评价确认了三个品种的苦味强度存在显著差异：CX苦度评分最高（7.8 ± 0.52），LHT居中（6.0 ± 0.34），LJL最低（3.1 ± 0.25），与电子舌分析结果高度一致。

3.4 Metabolic profiles and differential metabolites in three varieties of blue honeysuckle

非靶向代谢组学共鉴定出692种代谢物，包括71种氨基酸及其衍生物、105种酚酸、176种黄酮类、104种脂质等。PCA分析显示PC1和PC2的累计贡献率达71.8%，三个品种明显分离且组内重复性好。差异代谢物分析（|log₂FC| ≥ 1且p ≤ 0.05）显示：CX vs LHT有221个差异代谢物（151个上调，70个下调），CX vs LJL有185个差异代谢物（119个上调，66个下调），LHT vs LJL有154个差异代谢物（84个上调，70个下调）。差异代谢物主要集中在黄酮类、氨基酸及其衍生物、脂质和酚酸四大类。韦恩图分析发现三个品种共享24个差异代谢物，包括异超氧化物、松属素-7-O-新橙皮糖苷、L-苯丙氨酸和L-异亮氨酸等。

3.5 Screening and differential analysis of potential bitter metabolites among different varieties of blue honeysuckle

通过与BitterDB数据库比对，共筛选出73种潜在苦味代谢物，包括11种氨基酸及其衍生物、11种酚酸、30种黄酮类、6种单宁等。黄酮类苦味物质最为多样（30种），包括乔松素、柚皮素、根皮素、木犀草素、圣草酚、儿茶素、表没食子儿茶素等及其糖苷衍生物。其中山奈酚-3-O-半乳糖苷和山奈酚-3-O-芦丁糖苷的苦味阈值极低（分别为0.00067 mmol/L和0.00043 mmol/L），远低于奎宁盐酸盐（0.3 mmol/L）。CX中圣草酚、异鼠李素、山奈酚-3-O-半乳糖苷、木犀草素-6-C-葡萄糖苷等显著上调。氨基酸类苦味物质包括L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸等，它们的苦味阈值分别为30、12、10、4和5 mmol/L。与LJL相比，L-组氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-苯丙氨酸在CX和LHT中均显著上调（FC ≥ 2）。酚酸类苦味物质包括苯甲酰胺、水杨酸、龙胆酸、咖啡酸和熊果苷等，其中熊果苷苦味阈值仅0.9 mmol/L。脂质中鉴定了棕榈酸、α-亚麻酸、亚油酸、硬脂酸等苦味脂肪酸，其中α-亚麻酸、亚油酸和硬脂酸在蓝果忍冬中含量较高（峰面积 > 1 × 10⁷）。单宁类苦味物质包括原花青素B1、B2、B3、B4、C1和C2，其中原花青素B2、B4和C1在低苦品种LJL中表达更高。

3.6 Analysis of the biosynthetic pathways of bitter compounds in blue honeysuckle

KEGG富集分析表明差异苦味代谢物主要富集在次级代谢物生物合成（ko01110）、代谢通路（ko01100）、氨基酸生物合成（ko01230）、类黄酮生物合成（ko00941）等通路。氨基酸生物合成通路中，支链氨基酸（L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸）及其代谢中间体（2-氧代异戊酸、3-异丙基苹果酸）在高苦品种CX中显著积累；L-组氨酸也可能参与苦味形成。类黄酮生物合成通路中，柚皮素、普鲁宁、柚皮苷和杜荆素在CX和LHT中显著上调，而在LJL中含量较低。表儿茶素在三个品种中均有较高积累（峰面积 > 1 × 10⁶），但在LJL中含量最高，表明其可能贡献整体味觉复杂性而非主要苦味来源。L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸、柚皮苷和杜荆素的积累模式与苦味梯度（CX > LHT > LJL）一致，被认为是蓝果忍冬苦味的关键贡献因子。

4 Conclusion

本研究通过整合感官评价、电子舌技术和非靶向代谢组学方法，系统揭示了三个蓝果忍冬品种苦味差异的关键化合物和代谢通路。黄酮类和氨基酸及其衍生物是苦味的主要贡献者，特别是L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸和杜荆素等物质在氨基酸生物合成和类黄酮生物合成通路中的富集，共同定义了CX品种的强烈苦味特征。这些发现为在保留生物活性苦味成分的同时改善蓝果忍冬风味品质提供了重要依据，在功能性食品开发和育种策略中具有应用潜力。