噬菌体特异性抑制产气荚膜梭菌在复杂鸡盲肠微生物群中的体外作用及机制研究

本研究通过体外鸡盲肠微生物模型(i-screen)，证实特异性噬菌体#7能有效抑制产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)LMG 11264株增殖，效果与阿莫西林(amoxicillin, 10 μg/mL)相当且优于克林霉素(clindamycin)。该噬菌体仅靶向接种菌株，不影响内源性微生物群落多样性(Chao指数p=1)，展现了噬菌体疗法在替代抗生素控制食源性疾病方面的精准性与生态安全性。

　　

引言

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是引起食源性疾病的重要病原体，95%的人类感染与污染肉类产品相关。在家禽中，该菌感染可能导致坏死性肠炎(necrotic enteritis)，其高死亡率与抗生素耐药性密切相关。寻找替代治疗方案成为当务之急，其中特异性噬菌体(bacteriophages)的体外筛选策略为开发新型干预手段提供了 promising 方向。

材料与方法

研究采用鸡盲肠来源的复杂微生物群作为体外模型(i-screen)，接种产气荚膜梭菌LMG 11264株(10⁶ cfu/mL)，并分别施加噬菌体#7(10⁴ pfu/mL)、阿莫西林(amoxicillin, 10 μg/mL)和克林霉素(clindamycin, 10 μg/mL)干预。在孵育0、24和48小时采集样本，进行gDNA提取、qPCR分析和宏基因组测序。噬菌体从荷兰阿默斯福特池塘水体中分离，通过噬斑测定验证其特异性。基因组分析采用Illumina NovaSeq 6000平台，使用SPAdes进行组装和FastANI进行核苷酸同源性比较。微生物群落分析通过Kraken2和Bracken进行物种分类与丰度估算，α多样性采用Chao指数和Shannon指数评估。

结果

噬菌体分离与表征

从22份样本中仅分离到一株能形成噬斑的噬菌体#7，其效价达10⁹ pfu/mL。该噬菌体对LMG 11264、ATTC 13124、DSM 11781和LMG 12225株均形成噬斑，但对LMG 12224和LMG 10468无作用。基因组分析显示该噬菌体与已报道的多个产气荚膜梭菌噬菌体具有高度序列相似性。

微生物群落组成动态

未处理组中，接种的产气荚膜梭菌在24小时和48小时分别达到10⁸和10⁹基因组当量/mL，相对丰度升至93%和66%。噬菌体干预使菌量降至接近0%，效果与阿莫西林相当，而克林霉素组仅降至10%。内源性产气荚膜梭菌(初始丰度18%)对噬菌体不敏感，随时间推移降至0.7%。

多样性影响

α多样性分析显示，未接种对照组Chao指数从T0的33.6±10升至T48的111.67±14.15。产气荚膜梭菌接种使多样性显著降低(32.67±3.06)，而噬菌体处理使多样性恢复至127±54.56。β多样性分析表明抗生素处理显著改变微生物群落结构，而噬菌体处理组与未处理组聚类接近。

微生物类群特异性变化

DESeq2分析揭示，产气荚膜梭菌接种组中 Ligilactobacillus salivarius 显著富集。噬菌体处理使病原菌和相关菌群减少，而大肠杆菌(Escherichia)等物种增加。抗生素处理导致乳酸杆菌(Lactobacillus)和 Limosilactobacillus 等菌群显著增殖，表明潜在耐药性产生。

讨论

研究成功建立96孔板高通量体外模型(i-screen)，可有效模拟产气荚膜梭菌在鸡盲肠微生物群中的增殖动态。噬菌体#7展现出与阿莫西林相当的抑制效果，且具有高度特异性，不影响内源性微生物群落结构。该模型为研究噬菌体-宿主动力学、评估剂量效应和联合疗法提供了灵活平台。值得注意的是，抗生素处理引发的乳酸杆菌增殖可能与其携带的抗生素耐药基因(antibiotic resistance genes)相关，这通过宏基因组分析得到印证。研究强调噬菌体疗法在减少抗生素使用、维持微生物生态平衡方面的潜在价值，为开发精准抗菌策略提供了重要理论基础。

未来研究可整合多组学方法，深入解析噬菌体干预下的代谢组变化(如短链脂肪酸SCFA)和抗性基因转移机制，为临床应用提供更全面的科学依据。