E2F1通过调控细胞衰老抑制甲状腺乳头状癌恶性表型：生物信息学分析与实验验证揭示其预后价值与治疗潜力

本研究通过整合TCGA数据库与CellAge细胞衰老基因集，利用生物信息学方法筛选出E2F1作为甲状腺乳头状癌（PTC）的关键预后相关衰老基因。实验验证表明E2F1在PTC组织中高表达，并通过激活p53-p21和p16INK4a-RB通路诱导细胞衰老，进而抑制肿瘤细胞增殖、迁移与侵袭。构建的列线图模型整合E2F1表达与临床特征可精准预测患者预后，为PTC的靶向治疗提供了新策略。

　　

1 引言

甲状腺癌（THCA）是全球内分泌系统最常见的恶性肿瘤之一，根据2022年全球癌症统计数据，其年新增病例超过82.1万例，位居第七大常见癌症。甲状腺乳头状癌（PTC）占所有甲状腺癌病例的80%–90%，虽然通常预后良好，但约10%–15%的中分化PTC变体表现出侵袭性临床行为和高死亡率。细胞衰老作为肿瘤发生过程中的关键环节，通过持续细胞周期阻滞发挥肿瘤抑制作用，但也可通过衰老相关分泌表型（SASP）介导的炎症、基质重塑和免疫重编程促进癌症发展，呈现"双刃剑"效应。在甲状腺癌中，大多数研究表明其发展与细胞衰老密切相关，但缺乏对细胞衰老与临床结局双重整合的系统研究。

2 材料与方法

研究从TCGA数据库获取502例PTC患者和48例正常个体的转录组数据及临床资料，从CellAge数据库获取279个细胞衰老相关基因。通过"limma"R包筛选差异表达的细胞衰老基因（DECSG），采用单变量Cox回归分析筛选预后相关细胞衰老基因（PCSG），并通过多变量Cox回归分析确定关键基因。采用实时定量PCR（RT-qPCR）、细胞转染、集落形成实验、Western blot、伤口愈合实验、Transwell实验、CCK-8试剂盒、流式细胞术和免疫组化染色等技术验证核心基因功能。

3 结果

3.1 预后相关细胞衰老基因的鉴定

通过差异表达分析鉴定出23个DECSG（15个上调，8个下调），单变量Cox回归筛选出25个PCSG。Venn图分析显示MAP3K6、LGALS3、PLA2R1和E2F1为重叠基因，多变量Cox回归最终确定E2F1为与PTC预后独立相关的关键基因。

3.2 E2F1在PTC中的表达特征

泛癌分析显示E2F1在多种肿瘤组织中高表达。在TCGA-PTC数据集和GEO数据库（GSE33630、GSE3467）中，E2F1在PTC组织中的mRNA表达显著高于正常甲状腺组织（p<0.05）。配对样本分析进一步证实了这一趋势。免疫组化结果显示E2F1蛋白在PTC组织中的表达水平也显著高于正常组织，HPA数据库的验证结果一致。

3.3 E2F1的临床价值

Kaplan-Meier生存分析显示E2F1高表达组患者总生存时间显著延长（p=0.0002）。ROC曲线分析显示E2F1区分PTC患者与正常个体的AUC值为0.92（95%CI:0.88-0.97），表明其具有良好的预后预测能力。

3.4 E2F1对PTC肿瘤细胞衰老的影响

Western blot分析显示，与NC-OE组相比，E2F1-OE组p21、p53、γ-H2AX和p16^INK4a蛋白表达显著增加，而PPP1A和p-pRB水平显著降低。流式细胞术显示E2F1过表达导致G0/G1期细胞比例显著增加，S期和G2/M期细胞减少，表明E2F1过表达诱导细胞周期阻滞。Edu实验表明E2F1过表达组Edu阳性细胞比例显著降低。

3.5 E2F1对正常甲状腺细胞的影响

在正常人甲状腺滤泡上皮细胞（Nthy-ori 3-1）中敲低E2F1后，细胞活力显著增强，迁移距离增加，Cyclin D1表达升高而P21水平降低，提示E2F1下调可能通过增强增殖和迁移能力驱动正常细胞的恶性转化。

3.6 E2F1对PTC细胞恶性表型的影响

Transwell实验显示E2F1过表达显著减少侵袭细胞数量，而敲低E2F1则增加侵袭能力。伤口愈合实验和集落形成实验表明E2F1过表达抑制细胞迁移和克隆形成能力。CCK-8实验证实E2F1过表达降低肿瘤细胞活力，而敲低E2F1则增强细胞活力。

3.7 基因集富集分析

GSEA分析显示E2F1高表达组富集于DNA复制、细胞周期、碱基切除修复、同源重组和p53信号通路，表明E2F1可能通过调控这些通路影响PTC进展。

3.8 免疫微环境与免疫检查点相关分析

E2F1表达与B细胞、CD8⁺T细胞和树突状细胞的浸润水平呈正相关。与免疫检查点的相关性分析显示E2F1与PDCD1、IDO1和LAG3负相关，与CTLA4和CD274正相关。

3.9 列线图构建

基于多变量Cox回归分析确定年龄、M分期和肿瘤长度是独立预后因素，与E2F1联合构建列线图模型。ROC曲线显示该模型在365、1095和1825天的AUC值分别为0.95、0.96和0.97，校准曲线显示良好的一致性，DCA曲线表明模型具有较高的临床净获益。

4 讨论

E2F1作为E2F家族的核心成员，在细胞周期信号通路和凋亡中发挥重要作用。本研究首次发现E2F1在PTC中发挥肿瘤抑制作用，这与大多数报道E2F1为原癌基因的研究相反。机制上，E2F1高表达可能通过增加复制通量引发复制应激和DNA损伤反应（DDR），通过ATM/ATR–CHK2通路稳定E2F1，使其功能从促增殖驱动因子转变为损伤传感器/效应器。E2F1通过p14^ARF–MDM2轴稳定p53并上调p21，或通过p16–RB通路触发不可逆细胞周期阻滞和衰老，从而抑制肿瘤细胞增殖。PTC中TP53突变负荷较低且p53功能相对保留，使E2F1偏向"DDR-衰老"轨迹而非促增殖程序，这为其与良好预后的关联提供了机制解释。

E2F1驱动的衰老还通过SASP重塑肿瘤微环境以限制转移潜能。一方面，衰老重编程细胞骨架、粘附和运动程序， intrinsically降低迁移和侵袭能力；另一方面，SASP因子（如IL-6/IL-8和趋化因子）增强免疫监视和吞噬清除，创建肿瘤抑制生态系统。E2F1高表达与B细胞、CD8⁺T细胞和树突状细胞呈正相关，表明SASP相关趋化因子可能促进抗原呈递和效应T细胞招募，放大"衰老监视"作用。

5 优势与局限性

本研究优势在于首次发现E2F1在PTC中的肿瘤抑制作用，为研究E2F1在不同癌症中的不同作用提供了参考；结合生物信息学分析与实验验证初步探讨了潜在机制。局限性包括未通过体内外实验验证具体机制（如免疫细胞通过低表达E2F1促进肿瘤细胞转移的作用），仅使用两种PTC细胞系可能导致结果偏差，免疫细胞浸润仅通过TIMER数据库评估而未通过流式细胞术或免疫荧光验证。

6 结论

E2F1作为细胞衰老相关基因在PTC中上调表达，其高表达与患者良好预后显著相关。E2F1通过调控细胞衰老抑制恶性肿瘤表型的发展，从而降低不良预后风险。基于E2F1和临床特征构建的预测模型能准确预测患者不良预后，E2F1可能作为PTC的潜在治疗靶点。