溶瘤痘苗病毒共表达肿瘤相关抗原表位与IL2协同增强抗肿瘤免疫治疗小鼠4T1乳腺癌的研究

本研究创新性构建共表达鼠源IL2（mIL2）与肿瘤相关抗原（TAA）表位的重组溶瘤痘苗病毒（rVACV），在4T1小鼠乳腺癌模型中证实其通过协同激活CD4+/CD8+ T细胞及抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应，显著抑制肿瘤生长，为联合免疫治疗提供新策略。

　　

1 引言

溶瘤痘苗病毒（VACV）因其巨大的外源基因承载能力（>25kb）、天然肿瘤趋向性和溶瘤特性，成为癌症免疫治疗中最具前景的病毒载体之一。其安全性已通过历史上作为天花疫苗的广泛应用得到验证。近年来，基于病毒的溶瘤免疫治疗策略不仅直接裂解肿瘤细胞，还能激活系统性抗肿瘤免疫应答。本研究旨在开发一种新型溶瘤VACV，使其共表达鼠白细胞介素2（mIL2）与肿瘤相关抗原（TAA）表位，以协同激活细胞毒性CD8⁺ T细胞和CD4⁺ T细胞，增强对小鼠乳腺癌模型的治疗效果。

IL2作为第一个被FDA批准用于癌症治疗的细胞因子，在免疫细胞的生长与分化中扮演关键角色，尤其影响T细胞、B细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）。然而，IL2的治疗效果具有剂量依赖性，且会同时激活效应T细胞与调节性T细胞（Treg），从而表现出免疫刺激与免疫抑制的双重性。临床研究表明，IL2与多肽疫苗的联合应用相较于单一IL2治疗能显著提高客观缓解率，提示联合策略的潜力。

肽疫苗通过抗原呈递细胞（APC）主要组织相容性复合物I类（MHC class I）或II类（MHC class II）分子呈递抗原表位，激活特异性T细胞识别并杀伤肿瘤细胞。肿瘤相关抗原（TAAs）如SPARC和MuLV gp70在肿瘤细胞中过度表达，而在正常组织中表达水平较低，因此其衍生表位可作为癌症疫苗的理想靶点。

2 材料与方法

2.1 细胞系与病毒

研究使用非洲绿猴肾成纤维细胞CV-1和小鼠乳腺癌细胞系4T1及N2C。通过基因工程技术构建稳定表达荧光蛋白的4T1-turboFP635和N2C-eGFP细胞系，所有细胞均在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养。

2.2 肽段合成

研究所用肽段包括SPARC_143-151 (DYIGPCKYI, S1)、SPARC_225-234 (MYIFPVHWQF, S2)、AH1 (SPSYVYHQF, gp70_423–431)及其变异体AH1-A5 (SPSYAYHQF)，纯度均高于90%。体外实验使用的刺激肽混合物浓度为1μg/ml，包含等量的上述四种肽段。

2.3 病毒株构建

以VACV Lister株LIVP1.1.1为骨架，利用Psyn（E/L）启动子驱动mIL2基因插入胸苷激酶（TK）基因座，构建表达mIL2的病毒株LVP-R-G-mIL2。进一步设计合成包含Ig kappa链引导序列、四种TAA表位（AH1、S1、S2、AH1-A5）通过(G4S)2柔性连接子串联、C端带3×FLAG标签的融合蛋白基因，并将其插入病毒基因组非表达区（位点157-158之间），最终获得共表达mIL2与TAA表位的重组病毒LVP-R-G-SPARC/gp70-peptides-mIL2。

2.4 蛋白表达与细胞分析

通过Western blot验证病毒感染4T1细胞后mIL2（约20kDa）和融合蛋白（约15kDa）的表达。流式细胞术分析4T1和N2C细胞表面MHC I类分子H2-K^d和H2-L^d的表达水平。采用IncuCyte^?S3实时成像系统监测不同浓度mIL2对肿瘤细胞增殖的直接影响。

2.5 动物实验

在BALB/c小鼠右背侧皮下接种1×10⁵个4T1细胞建立肿瘤模型。13天后，小鼠随机分为四组，分别经尾静脉注射PBS、对照病毒C1-opt1、LVP-R-G-mIL2或LVP-R-G-SPARC/gp70-peptides-mIL2（剂量均为1×10⁷ pfu/100μl）。定期监测肿瘤体积和小鼠体重，评估治疗效果与毒性。

2.6 免疫细胞分析

处死小鼠后取脾脏制备单细胞悬液，通过流式细胞术分析脾淋巴细胞中CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺ T细胞比例及PD-1表达水平。采用磁珠分选分离CD8⁺ T细胞，经肽混合物与抗CD28抗体刺激后，检测细胞内IFN-γ表达以评估抗原特异性T细胞反应。

2.7 体外共培养杀伤实验

将分离的CD8⁺ T细胞（效应细胞）与表达荧光蛋白的靶细胞（4T1-turbo或N2C-eGFP）按一定比例共培养，在肽混合物存在或不存在的情况下，利用IncuCyte^?S3系统实时监测靶细胞死亡过程，定量评估抗原特异性CTL的杀伤效能。

3 结果

3.1 重组病毒的设计与验证

Western blot证实4T1和N2C细胞均表达SPARC蛋白（约40kDa）及MHC I类分子H2-K^d和H2-L^d。成功构建的重组病毒在感染4T1细胞后能有效表达mIL2和SPARC/gp70融合蛋白。细胞增殖实验显示，外源添加mIL2能直接抑制4T1和N2C细胞的生长，且呈浓度依赖性。

3.2 体内抗肿瘤效果

在4T1荷瘤小鼠模型中，注射LVP-R-G-SPARC/gp70-peptides-mIL2病毒的小鼠肿瘤生长受到显著抑制，生存期延长，效果明显优于单独表达mIL2的病毒组或对照组。治疗过程中小鼠体重未见显著下降，表明病毒表达mIL2的系统性毒性较低。流式分析显示，mIL2表达病毒处理组小鼠脾脏中CD4⁺和CD8⁺ T细胞数量显著扩增，但CD4⁺/CD3⁺和CD8⁺/CD3⁺比例及PD-1表达水平无显著变化。此外，仅肽表达病毒组小鼠来源的CD8⁺ T细胞在肽刺激后能产生大量IFN-γ，证实病毒表达的融合表位成功诱导了抗原特异性T细胞应答。

3.3 抗原特异性CTL杀伤效能

体外共培养实验表明，从LVP-R-G-SPARC/gp70-peptides-mIL2治疗组小鼠分离的CD8⁺ T细胞，在肽混合物存在下，对4T1-turbo靶细胞展现出接近100%的杀伤效率，显著高于其他组。对N2C-eGFP细胞的杀伤实验进一步证实该杀伤作用具有抗原特异性：仅当存在相应肽段刺激时，才引发显著细胞毒性。通过定量分析共培养早期（2-12小时）的杀伤焦点数量，发现共表达病毒组小鼠体内激活的抗原特异性CTL数量最多，mIL2单独表达组次之，而对照组则极少。

4 讨论

本研究成功构建了共表达mIL2与多重TAA表位的重组溶瘤VACV，证实其在 murine 4T1乳腺癌模型中可通过双途径增强抗肿瘤免疫：1）病毒表达的mIL2系统性地扩增了CD4⁺和CD8⁺ T细胞库；2）病毒表达的TAA表位成功诱导了抗原特异性CTL应答，两者协同作用显著抑制了肿瘤生长。创新的实时成像杀伤实验直观展示了抗原特异性CTL的直接溶瘤能力。

尽管基于TAA的疫苗策略存在潜在自身免疫风险，但本研究中所选表位经验证具有良好的安全性。此外，VACV介导的局部IL2表达有效避免了系统性高剂量IL2治疗的严重毒性。未来临床转化中，采用肿瘤特异性抗原（TSAs）替代TAAs、以及应用工程化低毒性IL2变体，有望进一步提升治疗安全性及有效性。

综上所述，溶瘤VACV共表达IL2与肿瘤抗原表位的策略，为增强抗肿瘤CTL应答提供了一种高效、安全的联合免疫治疗新平台，具有广阔的临床转化前景。