星形胶质细胞连接蛋白43（Cx43）诱导性过表达可减轻实验性颞叶癫痫进展

为解决星形胶质细胞间隙连接（GJ）通讯在神经系统疾病中的作用机制问题，研究人员开展星形胶质细胞特异性诱导过表达连接蛋白43（Cx43）的转基因小鼠模型研究，发现增强Cx43介导的GJ耦合可减轻慢性癫痫活动强度和海马硬化程度，为靶向星形胶质细胞网络治疗颞叶癫痫（TLE）提供新策略。

　　

哺乳动物大脑中的星形胶质细胞通过间隙连接（Gap Junction, GJ）通道广泛互联，形成与神经元网络重叠相互作用的大规模功能网络。这种合胞体组织对星形胶质细胞调节神经元活动的能力至关重要，并使得大规模神经元群体的协调控制和同步成为可能。GJ通道允许分子量高达约1 kDa的离子和小分子（如核苷酸、第二信使、神经递质和能量代谢物）进行细胞间扩散。它们由连接蛋白（Connexin, Cx）家族的跨膜蛋白组成。六个Cx亚基寡聚形成半通道（connexon），与相邻细胞的半通道对接形成完整的细胞间通道。在海马中，星形胶质细胞间的通讯主要由Cx43通道介导，其次是由Cx30组成的通道。Cx43有四个跨膜结构域、两个细胞外环、一个胞质环以及细胞内N端和C端结构域。Cx43的C端结构域通过包含多个蛋白-蛋白相互作用基序和各种激酶的磷酸化位点发挥核心调节功能，这些位点调节通道门控、细胞内运输、蛋白周转以及支架蛋白的招募。

尽管星形胶质细胞网络在健康和疾病大脑中的作用已通过耦合缺陷的星形胶质细胞小鼠模型获得大量信息，但其在颞叶癫痫（Temporal Lobe Epilepsy, TLE）发生发展中的具体作用和机制尚未完全阐明。特别值得注意的是，在人类TLE伴海马硬化（Hippocampal Sclerosis, HS）的术后海马样本中，星形胶质细胞完全缺乏GJ耦合。在实验性TLE模型中，研究人员重现了这一病理现象，并证明星形胶质细胞解耦联以及受损的K⁺清除功能先于神经元死亡和自发性癫痫发作的出现，提示其在癫痫发生中具有因果作用。此外，在人类和实验性TLE中的研究均表明，解耦联并非由于Cx表达减少，而是源于Cx43的亚细胞重新分布和磷酸化改变。近期证据表明，这些变化是由小胶质细胞来源的可溶性TNFα驱动的。

为了进一步阐明这一具有临床意义的课题，研究人员构建了在星形胶质细胞中可诱导过表达Cx43的小鼠（Cx43⁺），并研究了增强星形胶质细胞耦合对海马功能和癫痫发生的影响。

本研究主要采用了以下几种关键技术方法：1） 利用转基因技术构建了可在星形胶质细胞中他莫昔芬诱导过表达Cx43的小鼠模型（GLAST-CreERT2:CAG-floxSTOP-Cx43-P2A-mCherry），并通过免疫组化、Western Blot等技术验证了过表达的特异性和效率；2） 采用全细胞膜片钳技术结合生物胞素（biocytin）填充，评估了星形胶质细胞的被动膜特性和细胞间耦合效率；3） 通过免疫荧光染色和三维形态学分析（使用MotiQ插件），定量分析了星形胶质细胞的密度、体积、分支复杂性以及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的免疫反应性；4） 利用细胞外场电位记录技术，在海马切片上研究了Schaffer侧支-CA1通路的基础突触传递和θ节律爆发刺激（TBS）诱导的长时程增强（LTP）；5） 通过立体定位注射海人酸（Kainic Acid, KA）到小鼠新皮层诱导癫痫持续状态（Status Epilepticus, SE）和慢性TLE模型，并植入遥测脑电图（EEG）发射器进行长达4周的连续EEG监测，以量化急性和慢性期的癫痫活动；6） 使用免疫组织化学方法（抗NeuN、GFAP抗体染色）评估了海马硬化（HS）的多个参数，包括CA1锥体神经元数量、齿状回（DG）颗粒细胞弥散（GCD）程度以及CA1辐射层（str. rad.）的胶质增生程度。

表征Cx43过表达小鼠

研究人员通过将他莫昔芬诱导的CreERT2重组酶与星形胶质细胞特异性启动子GLAST以及 Rosa26 位点上的 CAG-floxSTOP-Cx43-P2A-mCherry 表达框相结合，成功构建了星形胶质细胞特异性诱导过表达Cx43的转基因小鼠系（Cx43⁺）。免疫组化染色显示，海马中89±6.3%的GFAP⁺星形胶质细胞共表达mCherry，而几乎所有（98±1.2%）mCherry⁺细胞也显示GFAP免疫反应性，表明重组效率高且具有星形胶质细胞特异性。Western Blot分析证实，Cx43⁺小鼠海马中总Cx43蛋白水平和质膜相关Cx43蛋白水平均显著升高。通过膜片钳记录期间填充生物胞素评估细胞间耦合效率，发现Cx43⁺小鼠海马中生物胞素阳性的星形胶质细胞数量比对照组（CTRL）小鼠增加了约20%。然而，Cx43过表达并未影响星形胶质细胞的被动膜特性，包括静息膜电位（RMP）、膜电阻（Rm）和膜电容（Cm）。

Cx43过表达改变星形胶质细胞形态但不改变成年神经发生

与耦合减少或缺失会导致星形胶质细胞肥大和反应性增生的既往研究相反，增强耦合产生了不同的形态学影响。在Cx43⁺小鼠海马CA1辐射层，S100β⁺细胞密度未受影响，但通过三维重建发现，Cx43⁺星形胶质细胞的体积显著减小。与此一致的是，Cx43⁺小鼠的GFAP免疫反应性也降低了。高分辨率共聚焦图像的三维重建和骨架化模型分析进一步显示，Cx43⁺星形胶质细胞的分支数量显著减少，但分支的ramification index（ramification index = 细胞表面积 / 4π(3×细胞体积/4π)^2/3）和平均过程长度保持不变。这些数据表明，Cx43过表达不影响星形胶质细胞密度，但改变了其形态，使其体积更小、分支更少。免疫组化染色显示，mCherry在齿状回（DG）颗粒下区（SGZ）中具有放射状胶质（Radial Glia, RG）样细胞形态的细胞中也有强表达。这些干细胞表现出谷氨酸摄取功能，并通过Cx43 GJ通道耦合，其耦合缺失会损害神经发生。然而，通过量化SGZ中Ki67⁺细胞的数量，研究发现Cx43过表达并未影响成年神经发生。

Cx43过表达不影响 synaptic plasticity

已知依赖于GJ的星形胶质细胞通讯在调节突触传递、突触可塑性、学习和行为中发挥作用。为了评估增加的星形胶质细胞Cx43表达是否影响突触长时程增强（LTP），研究人员在海马切片上记录了CA3-CA1 Schaffer侧支刺激诱发的场兴奋性突触后电位（fEPSP）。θ节律爆发刺激（TBS）诱导LTP后，Cx43⁺小鼠与CTRL小鼠之间的LTP幅度没有显著差异。此外，通过绘制fEPSP斜率随刺激强度（25-400 μA）增加的刺激-反应曲线，显示基因型间的基础突触传递没有差异。通过配对脉冲比率（PPR）评估的突触前释放概率在任何时候也未见基因型间差异。这些数据表明，Cx43过表达对兴奋性突触传递或其LTP没有明显影响。

Cx43过表达减轻慢性癫痫样活动

为了阐明Cx43过表达对癫痫发生和发展的影响，研究人员对Cx43⁺和CTRL小鼠进行了单侧皮层内KA注射的TLE模型实验。在KA注射后4小时，通过膜片钳记录后填充生物胞素评估了星形胶质细胞耦合情况。两种基因型小鼠的损伤侧（ipsilateral）生物胞素⁺星形胶质细胞数量均显著减少，但Cx43⁺小鼠的整体耦合效率显著高于CTRL小鼠。值得注意的是，Cx43⁺小鼠损伤侧的耦合水平与CTRL小鼠对侧（contralateral）的水平相当。通过遥测EEG记录连续监测4周，发现在KA诱导的癫痫持续状态（SE）期间，两种基因型在发作次数、发作持续时间或发作活动总时间上均无差异。对SE最初4小时的EEG数据进行棘波和频谱分析，也未发现基因型间在棘波频率或标准化高频（γ波段）功率方面存在显著差异。在经过相当的潜伏期后，两组小鼠发展成慢性自发性全面性发作（SGS）的比例无显著差异，且SGS的频率和持续时间也无差异。然而，有趣的是，在慢性期，Cx43⁺小鼠的标准化总EEG功率显著降低，δ波段功率也显著降低，而γ波段功率和棘波频率无差异。这些数据表明，星形胶质细胞Cx43过表达不影响SE的严重程度，但能减轻慢性癫痫活动。

Cx43过表达减轻TLE相关的硬化

海马硬化（HS）是耐药性TLE患者的常见发现，其特点是CA1和CA4区神经元丢失、反应性胶质增生和颗粒细胞弥散（GCD），并在本实验模型中可靠地重现。通过免疫组化染色评估HS程度，发现两种基因型小鼠损伤侧均出现严重的神经退行性变（CA1锥体神经元数量减少），且程度无显著差异。损伤侧的胶质增生（通过CA1辐射层GFAP免疫反应性评估）在两组中也相似地增加。然而，引人注目的是，Cx43⁺小鼠损伤侧的GCD明显轻于CTRL小鼠。这些数据表明，增加的星形胶质细胞耦合减轻了癫痫发作诱导的HS程度，具体表现为GCD的减弱。

本研究通过构建星形胶质细胞特异性诱导过表达Cx43的小鼠模型，首次在体证明增强星形胶质细胞间隙连接耦合可以改善慢性癫痫的疾病表型。结果表明，在健康大脑中，由星形胶质细胞网络介导的功能可能已处于最佳维持状态，增加耦合并不能进一步强化这些功能。然而，在病理状态下，例如在颞叶癫痫伴海马硬化中，星形胶质细胞网络发生了解耦联。本研究发现，在癫痫模型中维持或部分保留星形胶质细胞的耦合功能，虽然不能阻止癫痫的发生，但能够显著减轻慢性期的癫痫活动强度（表现为EEG总功率和δ波段功率降低）和海马硬化的病理改变（特别是减轻颗粒细胞弥散）。这强有力地表明，在人类和实验性MTLE-HS中观察到的星形胶质细胞耦合丧失参与了疾病 pathogenesis（发病机制）。星形胶质细胞解耦联可能通过削弱K⁺和谷氨酸的缓冲能力、破坏能量代谢物的扩散以及引起细胞肿胀等方式促进癫痫发生和进展；而维持其耦合则可能通过相反机制发挥抗癫痫作用。这些发现增进了我们对星形胶质细胞间隙连接耦合在健康和疾病中功能相关性的理解，并为设计针对星形胶质细胞网络的新治疗策略提供了重要的实验依据和潜在靶点，具有显著的临床转化价值。该研究发表于《Neurochemical Research》期刊。