流式细胞术CD64、CD300e与CD14表达模式揭示单核细胞成熟轨迹及其在髓系肿瘤诊断与原始细胞等效识别中的价值

本文推荐了一项关于单核细胞成熟标志物CD300e在流式细胞术中的应用研究。作者通过分析CD64、CD14与CD300e的表达模式，证实其在识别髓系肿瘤（尤其是单核细胞肿瘤）及定量原始细胞等效物方面具有重要价值。该研究为髓系肿瘤（如CMML、AMML、AMoL）的诊断与分类提供了新的流式细胞学依据，对临床精准分型与治疗监测具有重要意义。

　　

1 引言

在髓系单核细胞肿瘤的诊断与分类中，原始细胞、单核细胞和前单核细胞的精确量化至关重要。尽管已有形态学标准用于区分原始单核细胞、前单核细胞、未成熟单核细胞和成熟单核细胞，且骨髓病理学专家组在区分原始细胞/前单核细胞与成熟细胞方面表现出良好的一致性，但在日常实践中，基于骨髓涂片和外周血涂片区分单核细胞与前单核细胞仍具挑战性，其准确性受标本 adequacy、染色质量和阅片者经验的影响。流式细胞术（FC）和细胞化学染色有助于确定单核细胞系，但形态学仍是识别原始细胞/原始细胞等效物的金标准。数字成像和人工智能或许最终能辅助区分，但目前阶段，人类阅片者在识别单核细胞前体方面仍具优势。

多种免疫组织化学标志物已被提议用于识别原始单核细胞或未成熟单核细胞，包括干扰素调节因子8（IRF8）。在流式细胞术中，不同的抗CD14抗体表位可能区分成熟与未成熟单核细胞，例如抗CD14 MY4表位出现在早期前单核细胞阶段，而MO2表位仅出现在成熟单核细胞上。CD300e（别名IREM2）是一种在单核细胞和髓系树突状细胞中表达的免疫激活受体，已被提议作为流式细胞术中成熟单核细胞的标志物，并被纳入Euroflow AML/MDS panel。为评估CD300e是否能作为单核细胞前体定量的有用标志物并获取更多关于CD14/CD300e成熟模式的信息，我们评估了阴性及髓系肿瘤受累的外周血/骨髓（PB/BM）标本中CD64、CD14和CD300e的染色模式。

2 材料与方法

在这项IRB批准的研究中，回顾性识别了2024年6个月期间进行了单核细胞标志物流式细胞术panel检测的PB和BM病例。研究队列病例根据其是否符合阴性研究组或阳性研究组的标准被纳入。阴性组包括：1）白细胞（WBC）分类计数正常且流式解读正常的PB；2）无髓系肿瘤病史患者的阴性淋巴瘤分期骨髓。阳性组包括髓系肿瘤受累的PB和BM。从阳性组中，分离出慢性粒单核细胞白血病（CMML）、急性粒单核细胞白血病（AMML）和急性单核细胞白血病（AMoL）的BM病例（称为单核细胞肿瘤亚组）进行额外的统计分析。

使用的单管单核细胞标志物流式细胞术panel如表1所示。Panel中使用的CD14克隆识别LeuM3 CD14表位，该表位由MY4+MO2?单核细胞前体细胞以及MY4+MO2+成熟单核细胞表达。所有病例均作为诊断解读的一部分进行了额外的panel检测，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和其他髓系定向管。标本使用批量裂解法制备，流式细胞术检测使用10色FACSLyric流式细胞仪进行，数据分析使用FACSuite Application进行。由研究作者对每个病例的单核细胞定向panel的流式图进行重新分析，分析时知晓病例所属队列（阳性或阴性队列）。在排除双联体和碎片后，通过CD14、CD64或CD300e表达识别单核细胞群体。通过高CD64表达和低侧向散射圈定的单核细胞随后在CD14与CD300e散点图上进行亚群圈门，以可视化单核细胞成熟模式。在我们的panel抗原中，我们确定高CD64是定义单核细胞群体的最佳标志，因为我们的目的是捕获未成熟单核细胞（已知其CD300e和CD14表达可变）。由于非经典单核细胞CD64表达暗淡，我们的圈门策略富集了经典单核细胞，并可能排除了至少一部分非经典单核细胞。在部分病例中，由于存在低侧向散射的粒细胞或部分表达CD64的原始细胞，无法仅通过CD64表达分离单核细胞；在这些情况下，需要额外的CD16或CD34亚群圈门来分离单核细胞。BM病例中的原始细胞群体主要通过CD34表达进行量化，但在少数CD34阴性原始细胞病例中则使用CD117表达代替。

对每个阳性组BM涂片进行Wright-Giemsa染色的形态学评估，包括500个细胞的手工分类计数。虽然病例的髓系肿瘤阳性状态已知，但分类计数是在对流式结果和具体BM诊断不知情的情况下进行的。在形态学模糊的病例中，由两位研究作者审查涂片，就单个造血细胞的分类达成一致后再进行分类计数。对涂片质量和单核细胞形态学进行了观察记录。对于阴性组内的BM涂片，使用原始病理医师的解读和计数进行统计分析，未分离前单核细胞群体。从电子病历中检索外周血分类计数；这些包括自动化或手工分类计数。从电子病历中检索的支持信息包括用于诊断分类的病理报告、细胞遗传学（荧光原位杂交（FISH）和核型）结果以及髓系下一代测序（NGS）结果。

使用GraphPad Prism进行统计分析，定量数据使用Mann–Whitney检验和双尾P值，分类数据使用Fisher精确检验和双尾P值。

3 结果

共识别出118例病例（45例PB病例：12例阴性，33例阳性；73例BM病例：17例阴性，56例阳性），来自107名患者。人口统计学数据见表2和表3的前几行。阳性骨髓组中的诊断包括慢性粒单核细胞白血病（CMML, n=6例）、急性粒单核细胞白血病（AMML, n=11）、急性单核细胞白血病（AMoL, n=2）、低原始细胞髓系肿瘤/综合征（MDS, n=8）、原始细胞增多型MDS，也称为MDS/急性髓系白血病（MDS-IB或MDS/AML, n=3）、慢性髓系白血病（CML, n=1）、骨髓增殖性肿瘤（MPN, n=4）、急性早幼粒细胞白血病（APL, n=2）以及无非单核细胞分化的急性髓系白血病（AML, n=19）。阳性外周血组病例包括那些流式细胞术显示原始细胞或单核细胞增多或异常的患者，诊断包括CML（n=3）、AML（伴或不伴单核细胞分化, n=16）、CMML（n=2）、APL（n=5）以及MDS或MDS-IB/MDS/AML（n=7）。

3.1 骨髓中的成熟模式

在阴性BM病例中，通过高CD64表达识别的单核细胞在CD14与CD300e图上显示出一致的成熟模式，形成“倒L形”，最早期的形式缺乏CD14和CD300e，随后获得CD14，继而获得CD300e。图2显示了骨髓中不同准阶段正常单核细胞成熟的示例。在阴性PB病例中，通过高CD64表达识别的单核细胞均一性地对CD14和CD300e呈阳性。

总共39%（22/56）的阳性BM病例显示出与阴性病例不同的成熟模式（称为“异常成熟”）。成熟差异包括CD300e阳性而无CD14表达（n=13）、CD300e阳性群体伴暗淡CD14表达（n=2）或显著左移，以CD14和CD300e阴性单核细胞或CD14阳性且CD300e阴性单核细胞为主（n=7）。在阳性PB病例中，28/33（85%）显示出与阴性外周血中观察到的不同的CD14与CD300e模式（称为“异常”），包括提示循环中存在未成熟单核细胞的“倒L形”模式（n=13），或伴有左移的“倒L形”模式（n=7）、CD300e+CD14-成分（n=7）或CD300e+CD14dim成分（n=1）。图3提供了在PB和BM病例中观察到的正常和异常CD14与CD300e模式的示例。我们将骨髓单核细胞成熟模式与相应涂片上的单核细胞形态学进行了比较。在具有正常成熟模式的BM病例中，单核细胞形态学无异常。相反，在具有异常成熟模式的BM病例中，观察到频繁的非典型前单核细胞和单核细胞（图4）。

三名患者有多个BM病例纳入我们的研究队列。患者13，诊断为伴有KMT2A重排的AMML，在其治疗过程中的不同时间点显示出相似的异常CD14与CD300e成熟模式，异常成熟与BM诊断为持续/残留疾病一致（图6a）。患者7有两个BM活检纳入我们的研究。最初的BM活检，诊断为原始细胞增多型MDS（即MDS/AML，10%–15%原始细胞），展示了正常的单核细胞成熟模式。随后的BM活检，在治疗一个月后进行，诊断为持续性MDS伴1%原始细胞，展示了异常的单核细胞成熟模式（图6b）。这可能反映了治疗后患者原始细胞群体的减少，使得单核细胞相对扩增并识别出异常（左移）的成熟。患者31也有两个骨髓活检在我们的研究队列中。最初的BM病例，诊断为CMML，显示正常的单核细胞成熟模式。随后的BM活检，在不到一个月后获取，显示了异常的成熟模式，活检诊断为AMML（图6c）。从正常到异常成熟模式的转变可能反映了疾病进展。

3.2 单核细胞定量比较

表2和表3（分别为外周血和骨髓）提供了研究队列中阴性和阳性亚组内通过流式细胞术确定的单核细胞/单核细胞前体百分比的定量数据。表格还包括单核细胞/单核细胞前体流式定量与形态学定量的比较。通过CD64、CD14或CD300e百分比确定，阴性组和阳性组PB/BM病例之间的流式细胞术单核细胞百分比没有差异。在PB和BM中，阳性样本中CD300e-和CD300e-CD14-事件的百分比显著更高。对于PB，无论使用哪种FC标志物/策略进行定量，FC单核细胞%与显微镜分类计数的单核细胞%相似。相反，对于BM病例，当通过CD64阳性识别单核细胞时，FC单核细胞百分比与分类计数存在显著差异，但通过CD300e阳性识别时则无此差异。对于阳性BM病例，通过流式细胞术得到的CD300e-和CD300e-CD14-百分比与形态学的前单核细胞百分比显著不同。

3.3 单核细胞肿瘤亚组

在19例涉及单核细胞肿瘤的BM病例亚组中，10例显示出异常成熟模式：1/6的CMML，7/11的AMML，以及2/2的AMoL（图7）。如表4所示，对于单核细胞肿瘤亚组，流式细胞术单核细胞百分比（通过CD64+、CD14+或CD300e+）与形态学单核细胞百分比相似。流式细胞术CD300e-和CD300e-CD14-百分比与形态学前单核细胞百分比相似。流式细胞术原始细胞百分比与形态学原始细胞百分比以及形态学原始细胞加前单核细胞百分比显著不同。然而，流式细胞术原始细胞/未成熟单核细胞百分比（原始细胞 + CD300e- 或 原始细胞 + CD300e-CD14-）与形态学的原始细胞 + 前单核细胞百分比相似。

四个单独病例确实显示出流式细胞术原始细胞/未成熟单核细胞百分比（原始细胞 + CD300e- 或 原始细胞 + CD300e-CD14-）与形态学原始细胞 + 前单核细胞百分比之间存在临床显著阈值（20%）的差异（图8）。经进一步审查，病例11表现出显著的髓系左移，限制了形态学上区分早幼粒细胞和前单核细胞。在病例14中，涂片 markedly paucicellular 的性质限制了分类计数，提出了流式细胞术不能代表骨髓的可能性。病例18和19，诊断为AMoL，均显示出异常的成熟模式，表达CD300e而不表达CD14。这种异常模式未被我们事先定义的未成熟单核细胞（CD14+CD300e- 或 CD14-CD300e-）的流式细胞术定义所涵盖。当对病例18和19重新圈门以量化CD300e+CD14-群体时，百分比与形态学百分比非常匹配（病例18中29.2对35.4，病例19中41.4对37.6）（图8）。

4 讨论

早期的单核细胞前体缺乏CD34和CD117，具有高CD64和HLA-DR表达。随着它们成熟，单核细胞前体获得CD14和CD35的反应性，随后是CD300e。使用M?P9克隆，前单核细胞显示阴性至中等CD14，而成熟单核细胞显示高CD14表达。多个研究组已经研究了流式细胞术特征以辅助诊断慢性粒单核细胞白血病，注意到单核细胞免疫表型异常和未成熟单核细胞增加是有用的特征。异常的外周血单核细胞亚群分区，即经典（CD14+CD16-）单核细胞增加和非经典（CD14-CD16+）单核细胞减少，与CMML相关，并且是最新CMML诊断标准的一个要素；适当的单核细胞圈门对于评估很重要。原始细胞、单核细胞和前单核细胞的量化对于CMML的精确分型以及区分CMML与急性粒单核细胞白血病/急性单核细胞白血病至关重要，形态学评估仍然是金标准。

在本研究中，我们评估了临床实践中遇到的阴性及髓系肿瘤受累的外周血/骨髓（PB/BM）标本中CD64、CD14和CD300e的染色模式，目的是评估CD300e是否能作为单核细胞前体定量的标志物。我们得出结论，在通过高CD64表达和低侧向散射识别的单核细胞中，评估CD300e与CD14成熟图可以提供有诊断价值的信息。一个公认的潜在局限性是，鉴于我们panel和圈门策略的性质，我们的方法富集了经典单核细胞，而以非经典单核细胞为代价。

我们发现异常的CD300e/CD14成熟模式可能提示或为克隆性髓系过程提供支持性证据。85%的阳性外周血病例和39%的阳性骨髓病例存在异常的单核细胞成熟模式。异常的单核细胞成熟模式不仅见于单核细胞髓系肿瘤，也见于37%（7/19）的非单核细胞AML病例和28%（5/18）的非单核细胞非AML髓系肿瘤病例。类似地，在骨髓增生异常肿瘤（MDS）中也有异常低的CD300e+成熟单核细胞百分比的报道。重要的是，我们的“阴性”研究队列不包括髓系肿瘤的潜在模拟疾病，需要在广泛的反应性/治疗后情况（包括反应性单核细胞增多症）的病例队列中进一步研究我们的圈门/评估方法。尽管我们队列中数量很少，但两例inv(16)AML和两例RUNX1::RUNX1T1融合AML在异常成熟模式上的相似性提出了某些细胞遗传学异常可能与特定的CD300e/CD14单核细胞成熟模式相关的可能性。与其他免疫表型和形态学数据一起，这些模式可能为早期诊断过程中识别这些独特的急性白血病提供线索。需要对更多inv(16)、RUNX1::RUNX1T1融合以及其他潜在细胞遗传学异常的病例进行进一步调查。有趣的是，在骨髓病例的单核细胞肿瘤亚组中，除一例CMML外，所有CMML病例均显示正常的CD300e/CD14成熟模式，而异常成熟模式见于大多数AMML或AMoL病例。当考虑形态学上原始细胞/原始细胞等效物百分比接近临床显著阈值的单核细胞肿瘤时，骨髓中存在异常的单核细胞成熟模式可能为进展为AMML提供支持。

我们研究队列中的一名患者，诊断为伴有KMT2A重排的AML，在其治疗过程中的不同时间点的阳性骨髓中显示出相似的异常CD300e/CD14成熟模式。如果像该患者这样的异常成熟模式特征也适用于其他患者，它可能成为评估疾病状态的额外工具。需要调查其他具有诊断性和随访性BM病例的患者的成熟模式。重要的是，我们的研究队列不包括接受髓系肿瘤治疗患者的治疗后“阴性”骨髓。

对于骨髓病例的单核细胞肿瘤亚组，通过FC（CD300e-和/或CD300e-CD14-事件）对未成熟单核细胞的定量与形态学前单核细胞计数相对应；然而，单独来看，四个病例并不对应。在两个存在差异的病例中，由于涂片 markedly paucicellular 或异常的粒单核细胞细胞形态学，形态学评估（当前金标准）受到限制。其余两例是急性单核细胞白血病病例，我们最初用于量化未成熟单核细胞的圈门策略失败了。这两例显示CD300e表达而无CD14表达，使用CD300e+CD14-单核细胞前体的百分比可以更好地与形态学的前单核细胞计数对齐。我们的研究结果表明，在单核细胞肿瘤的背景下，通过高CD64和低侧向散射识别单核细胞，随后在CD300e与CD14图上量化未成熟或异常群体，可以辅助通过流式细胞术定量原始细胞等效物。单核细胞识别和原始细胞等效物定量的适当圈门策略似乎取决于标本的性质，包括是否存在发育异常的粒细胞以及在CD300e与CD14图上是否存在异常的单核细胞成熟模式。我们预计流式细胞术医师在评估这些病例时需要灵活 approach。

5 结论

原始细胞、单核细胞和前单核细胞的形态学量化是诊断和分类粒单核细胞肿瘤的金标准；然而，这种对单核细胞和单核细胞前体的分类可能很困难，并且存在阅片者间的 variability。本研究中使用的通过流式细胞术表征单核细胞CD300e/CD14成熟模式的方法，可能为未成熟单核细胞的识别和量化提供一种替代或补充方法；它也可能有助于识别非单核细胞克隆性髓系肿瘤的存在。需要进一步的研究在更广泛的髓系肿瘤和反应性/治疗后环境中确认这些结果，并在前瞻性环境中测试我们的方法。