神经元来源囊泡中的MicroRNA货物作为脑胰岛素失调的外周生物标志物研究

本研究发现，脑组织及脑源性小细胞外囊泡（sEV）中与胰岛素信号通路相关的特定microRNA（miRNA）在阿尔茨海默病（AD）中存在显著且一致的失调。通过分析2型糖尿病（T2DM）患者血浆中的神经元来源sEV（NDE），研究进一步揭示了这些miRNA的表达变化与认知功能损害及β-淀粉样蛋白（Aβ）水平密切相关，尤其在男性患者中表现更为显著。该研究为开发基于液体活检的脑胰岛素抵抗（bIR）生物标志物提供了新思路，并强调了性别差异在生物标志物研究中的重要性。

　　

1 背景

脑胰岛素抵抗（bIR）已被确认为阿尔茨海默病（AD）的重要风险因素，但其与周围胰岛素抵抗的关联及其对认知功能的影响尚未明确。中枢神经系统（CNS）中的胰岛素不仅参与葡萄糖代谢，还调节脑钙信号、神经元发育、突触传递、神经保护、tau蛋白磷酸化和β-淀粉样蛋白（Aβ）清除等过程。尽管周围胰岛素抵抗并不一定意味着CNS胰岛素抵抗，且AD大脑可能独立于2型糖尿病（T2DM）发展出胰岛素抵抗，但脑胰岛素信号通路异常与认知衰退的直接证据已在尸检脑组织中得到证实。由于脑组织的临床不可及性，开发基于血液的生物标志物成为研究bIR及其在认知衰退和AD中作用的重要方向。

细胞外囊泡生物学的发展为研究传统上难以接近的组织提供了独特机会。小细胞外囊泡（sEV）直径小于200纳米，能够穿过血脑屏障。对神经元来源sEV（NDE）中AD相关蛋白和microRNA（miRNA）的分析显示，在认知正常（CN）、轻度认知障碍和AD个体中，多种生物标志物水平存在差异。尽管通过分析NDE中磷酸化胰岛素受体底物（IRS）水平可以预测AD和其他神经系统疾病中的bIR，但由于磷酸蛋白在sEV中表达低、不稳定且 assay 灵敏度有限，分析NDE中的miRNA为评估bIR提供了更稳健的方法。

2 方法

2.1 研究参与者与临床数据

研究使用了来自华盛顿大学（UW）BioRepository and Integrated Neuropathology（BRaIN）实验室的12例神经病理学验证的AD捐赠者（6女6男）和12例年龄、性别及死后间隔匹配的对照捐赠者（6女6男）的中颞回（MTG）脑组织。所有UW捐赠者均基于神经病理学状态进行诊断。第二队列包括56例个体，其中28例认知正常（CN）和28例裁定混合性痴呆（aMD）患者，均患有T2DM，其血浆样本来自Wake Forest LookAHEAD MIND研究。

2.2 胰岛素信号聚合酶链反应阵列

使用ZymoResearch Quick-DNA/RNA Miniprep Plus Kit从MTG脑组织分离总RNA，并通过高通量cDNA逆转录试剂盒合成cDNA。使用Qiagen的RT2 profiler PCR阵列分析胰岛素信号通路中关键基因（n=84）的表达，并通过Cytoscape和STRING生成相互作用网络。

2.3 脑组织源性sEV（BDE）的分离

采用改良的温和组织 dissociation 方法分离sEV。组织切片在含有胶原酶III的Hibernate-E培养基中37°C震荡水浴30分钟，随后通过系列离心和0.22微米过滤去除细胞碎片和大囊泡。上清液通过30%蔗糖垫超速离心（100,000×g，90分钟）收集sEV。

2.4 血浆总sEV和NDE的分离与表征

依次使用L1CAM（CD171）和突触素表面标记从血浆中分离总sEV和NDE。血浆样本通过系列离心去除细胞碎片和大囊泡，总sEV使用ExoQuick分离，NDE通过生物素标记的L1CAM和突触素抗体与链霉亲和素磁珠分离。

2.5 纳米粒子跟踪分析

使用NanoSight NS300系统通过纳米粒子跟踪分析（NTA）测量sEV的大小和浓度。

2.6 总sEV和NDE的抗体阵列

使用Exo-check外泌体抗体阵列表征总sEV的典型外泌体标记物。NDE通过神经元标记物（NCAM、L1CAM、突触素和烯醇酶2）以及外泌体标记物（CD9、CD81、CD63和烯醇酶1）进行表征，钙联蛋白作为阴性标记。

2.7 脑组织、脑源性sEV和NDE中miRNA表达分析

通过TaqMan assays实时PCR分析miR-15b-5p、miR-16b-5p、miR-20b-5p、miR-125b-5p、miR-138-5p、miR-185-5p、miR-210-3p和miR-342-3p的表达。BDE和NDE使用cel-miR-39-3p spike-in RNA作为外参归一化控制，脑组织miRNA表达使用内参U6小核RNA归一化。

2.8 统计分析

使用Prism或SAS软件分析数据。miRNA表达数据以均值±SEM表示，通过2^?ΔΔCt方法计算相对于对照的 fold change。使用非参数Mann–Whitney检验比较两组间miRNA表达，Kruskal–Wallis检验比较种族组间表达。通过逻辑回归模型评估miRNA与认知损害的关系，线性回归模型分析miRNA表达与种族或胰岛素使用的关联，并使用Spearman偏相关系数调整年龄和性别后分析临床数据相关性。

3 结果

3.1 AD脑组织中胰岛素信号失调

在MTG脑组织子集（n=5对照，n=5 AD）中，胰岛素信号通路相关基因表达显示，AD组中AKT2、BRAF、GCK、GSK3β、PIK3R1、PTPN1、UCP1、IGF1R、INSR、KRAS、LDLR、NPY和RRAS2等基因表达存在显著差异。相互作用网络显示这些基因在≥3个样本/组中表达。

3.2 脑组织中调控胰岛素信号和AD相关通路的关键miRNA鉴定

通过文献检索确定调控胰岛素信号通路且与AD相关的miRNA，在MTG脑组织（n=12对照，n=12 AD）中通过TaqMan qPCR分析其表达。结果显示，miR-342-3p（p=0.0002）、miR-185-5p（p=0.0005）、miR-125b-5p（p=0.0004）、miR-16-5p（p=0.0011）、miR-138-5p（p=0.0121）、miR-15b-5p（p=0.0004）和miR-20b-5p（p=0.0001）表达显著上调，miR-210-3p表达无显著变化（p=0.31）。

3.3 脑组织和BDE在AD中反映胰岛素信号调控miRNA的相似变化

从脑组织分离的BDE大小和浓度在对照和AD组间无显著差异，且尺寸在sEV范围（<200纳米）。BDE中miR-342-3p（p=0.0012）、miR-185-5p（p=0.040）、miR-20b-5p（p=0.020）和miR-125b-5p（p=0.008）表达上调，miR-210-3p表达无显著差异，与脑组织表达趋势一致。Bland–Altman图显示脑组织与BDE间miRNA表达高度一致。

3.4 用于测量脑胰岛素信号的外周NDE

从T2DM参与者血浆分离总sEV和NDE，NTA和蛋白阵列显示其大小、浓度和纯度无显著差异。NDE中miR-342-3p（p<0.0001）、miR-185-5p（p<0.0001）、miR-125b-5p（p=0.0011）、miR-20b-5p（p=0.011）和miR-210-3p（p=0.003）在aMD组中表达显著上调，与脑组织和BDE变化基本一致。性别特异性分析显示，miR-342-3p、miR-185-5p、miR-125b-5p、miR-16-5p和miR-210-3p上调主要见于男性aMD患者，而miR-138-5p（p=0.0063）下调仅见于女性。

3.5 NDE中脑胰岛素信号相关miRNA表达预测认知损害

调整性别和年龄后，3MSE评分与miR-185-5p表达负相关（r=-0.35，p=0.032）。逻辑回归和AUC分析显示，miR-342-3p（AUC=0.887）、miR-185-5p（AUC=0.900）、miR-125b-5p（AUC=0.785）、miR-20b-5p（AUC=0.712）和miR-210-3p（AUC=0.757）与认知损害强烈相关。性别特异性分析中，男性患者miR-15b-5p（r=-0.60，p=0.008）和miR-185b-5p（r=-0.65，p=0.003）与3MSE评分负相关，miR-138-5p与血浆Aβ1-40（r=0.58，p=0.009）和Aβ1-42（r=0.54，p=0.018）水平正相关。男性中miR-185b-5p（AUC=1.00）、miR-342-3p（AUC=0.953）、miR-125b-5p（AUC=0.971）、miR-20b-5p（AUC=0.882）和miR-210-3p（AUC=0.762）对aMD状态有极高预测力，女性中仅miR-342-3p（AUC=0.823）有中等预测力。miR-342-3p表达与种族相关，非洲裔美国人表达较低，miRNA表达与胰岛素使用无显著关联。

4 讨论

胰岛素抵抗是T2DM的核心特征，近十年证据表明其与AD相关痴呆有关。脑胰岛素信号失调可能源于胰岛素不足、胰岛素抵抗或胰岛素受体功能障碍。脑胰岛素受体密度在多个脑区（包括认知相关区域）较高，表明胰岛素信号在大脑中具有广泛作用。胰岛素通过胰岛素受体信号减轻Aβ斑块形成，全身胰岛素受体敲除小鼠显示磷酸化tau水平增加。Aβ寡聚体处理原代神经元诱导胰岛素抵抗，减少树突胰岛素受体，而高胰岛素浓度处理减轻突触损失。

与脂肪组织和骨骼肌等经典胰岛素敏感组织不同，脑葡萄糖利用不依赖胰岛素，凸显了葡萄糖利用、胰岛素水平和胰岛素受体之间的脱节。这些差异表明脑胰岛素信号可能与周围胰岛素信号不同。然而，脑胰岛素信号评估在常规临床中尚未广泛应用，仅有少数研究调查血液生物标志物检测bIR的潜力。

鉴于其反映大脑病理状态和穿过血脑屏障的潜力，脑细胞来源sEV cargo已被用于预测bIR。例如，使用L1CAM+ NDE，bIR生物标志物与AD患者更严重的脑萎缩相关，强调其作为神经精神或神经退行性疾病bIR生物标志物的潜力。然而，这些研究仅依赖血浆sEV（和NDE），未在脑组织中验证分析的NDE生物标志物。本研究通过脑组织和血浆NDE的双重策略，提供了与胰岛素信号相关的miRNA生物标志物，为胰岛素失调与AD发病机制的关系提供了 insights。

需要注意的是，miRNA、mRNA或其他生物标志物在脑组织和血浆NDE之间可能没有一致的方向性变化，如miR-15b-5p和miR-210-3p表达不一致以及miR-138-5p在AD女性中的反向表达。这些差异可能受周围胰岛素信号、痴呆亚型（AD与aMD）、样本来源（尸检脑组织与活体血浆）或分离的NDE缺乏CNS神经元特异性影响。尽管如此，多个miRNA（miR-342-3p、miR-185-5p、miR-125b-5p、miR-16-5p和miR-20b-5p）在脑组织（健康对照与AD）和血浆NDE（CN与aMD）中显示相似的差异表达。有趣的是，它们区分健康个体与aMD的能力在男性中比女性更明显。先前研究表明，脑胰岛素敏感性存在显著性别差异，鼻内胰岛素输送 specifically 减少男性食物摄入和体脂，但对记忆功能的 beneficial effects 在女性中更明显。

本研究的miRNA在认知损害和胰岛素信号中均发挥重要作用。例如，miR-185-5p在低血糖 insult 后24小时T2DM患者中表达下调，并作为淀粉样前体蛋白的关键调节因子，AD患者血清外泌体中表达减少。Fu等描述了miR-342-3p对AD中Aβ代谢通路的调节活性，在AD捐赠者尸检海马组织和3xTg-AD小鼠模型中，miR-342-3p表达在AD进展中显著诱导，海马内注射miR-342-3p antagomir改善3xTg-AD小鼠认知缺陷。Sun等证明miR-342-3p参与妊娠糖尿病小鼠模型的胰岛素抵抗和肝糖异生。Zhang等通过RNA测序发现高脂高蔗糖饮食C57BL/6小鼠脑和脂肪组织中miR-342-3p上调，miR-342-3p敲除小鼠未发展肥胖或糖尿病，Snap25作为miR-342-3p主要靶基因，连接下丘脑神经元功能损害、过量食物摄入和糖尿病表型。 deep sequencing AD患者总血浆外泌体miRNA表达的研究发现，20个miRNA包括miR-125b-5p、miR-138-5p、miR-185-5p和miR-342-3p在AD个体中与年龄和性别匹配健康对照相比差异调节。类似地，血清中循环miR-125b-5p表达在AD个体中下调，而AD个体脑组织、血浆NDE和脑脊液（CSF）来源外泌体中miR-125b-5p表达上调。Banzhaf-Strathmann等发现过表达miR-125b的原代神经元显示tau过度磷酸化和抗凋亡因子下调，海马内注射miR-125b损害学习并诱导体内tau磷酸化。此外，miR-125b-5p表达通过AMP活化蛋白 kinase 抑制受葡萄糖调节，上调的miR-125b-5p表达介导氧化应激和炎症，并刺激APP、BACE1和Tau1表达。

尽管BDE和NDE中的miRNA有预测痴呆和脑胰岛素信号失调的潜力，本研究存在一些局限性。首先，虽识别了miRNA表达的显著变化，但这些变化不能确立为胰岛素失调或痴呆的原因或结果。未来研究应在相关小鼠模型中使用antagomir靶向这些差异表达miRNA，以确定其对胰岛素失调和认知损害的影响。其次，miRNA已知具有多效性信号靶点和生物学效应，因此不能排除这些miRNA除胰岛素信号和认知作用外还调节其他生物学功能。第三，需要分析其他脑细胞来源sEV（包括小胶质细胞或星形细胞来源sEV）中的这些miRNA，以提供对bIR及其对痴呆影响的更广泛理解。第四，不能声称NDE的排他性，因为标记物L1CAM和突触素并非神经元或CNS专属。未来探索L1CAM+和突触素+ sEV全转录谱的研究可能揭示其神经元特异性程度。尽管如此，这些标记可富集主要NDE亚群，代表检测生物体液中脑特异性miRNA变化的改进灵敏度。最近Nogueras-Ortiz等通过多种单EV技术确认L1CAM是NDE的可靠标记。第五，两个队列样本量小，可能影响统计效能，导致2型错误。分析还涉及多个miRNA和临床 measures，可能膨胀1型错误。然而，未应用多重检验校正，因为本研究主要目的是证明可行性和探索潜在趋势而非检验正式假设。因此，这些结果应谨慎解释，因为它们旨在生成假设而非提供 confirmatory 证据。第六，在T2DM组中，aMD仅通过认知评估定义，未使用 established AD神经影像和CSF measures，因此不能结论观察到的miRNA变化对AD特异。最后，两个队列受 eligibility 标准限制，不清楚结果是否适用于其他队列或人群。因此，这些结果需要在种族多样性的更大队列中并与 well-defined AD和AD相关痴呆生物标志物相关验证。尽管存在这些限制，本研究成功证明了分离外周循环系统NDE的 less-invasive 方法及其作为检测脑胰岛素信号失调和认知损害生物标志物的 usefulness。