综述：肿瘤内异质性在转移进展和耐药性中的作用

本综述系统阐述了肿瘤内异质性（ITH）在癌症转移和耐药性中的核心作用，深入探讨了其分子驱动机制（如遗传突变、表观遗传调控及肿瘤微环境互作），并评述了单细胞测序（scRNA-seq）、空间转录组等前沿技术及计算模型在解析ITH中的应用，为开发针对转移癌的新型治疗策略提供了关键见解。

　　

1 引言

癌症是全球主要的健康问题，2022年导致970万人死亡。尽管在癌症治疗方面投入了大量研究和资金，但癌症复发和治疗失败的情况仍然存在。转移是导致癌症患者预后不良和死亡率升高的主要原因之一。SEER数据库的研究显示，从1992年到2019年，有100万患者被诊断出患有转移性癌症，其中80.9%死于该疾病。转移是一个复杂的多步骤过程，涉及细胞从原发肿瘤迁移到局部或远处的身体部位，形成继发性肿瘤。为了在艰难的转移过程中生存下来，肿瘤细胞经历了一系列变化，包括细胞间粘附的丧失、获得间质特征、进入循环系统的微血管以及在次级部位成功定植。同时，转移细胞还与肿瘤微环境（TME）的组成部分相互作用，并逃避宿主免疫系统的免疫监视。由于这些巨大的选择压力，只有原发肿瘤中的一小部分细胞成功转移到远处部位。除了肿瘤进化，选择性癌细胞的转移潜力还取决于肿瘤内异质性（ITH）。

ITH指的是肿瘤内存在不同的癌细胞群体，这些群体由于内在和外在因素而表现出不同的表型和基因型特性。内在因素包括基因突变、转录组、表观遗传和翻译修饰，这些有助于重塑肿瘤细胞的细胞机制，产生不同的表型。肿瘤内的遗传ITH是拷贝数变异（CNV）、单核苷酸变异（SNV）、短插入或缺失（indels）以及结构和数值染色体畸变导致的基因突变积累的结果。导致异质性的两种主要基因突变包括驱动突变和乘客突变。驱动突变是提供癌细胞选择性优势并直接促进肿瘤起始和进展的基因改变。这些突变被正向选择，并在大多数原发癌症中成为显性克隆。驱动突变的例子包括TP53、PTEN、PIK3CA和MAPK。例如，在转移性乳腺癌（mBC）患者中，PTEN基因的缺失导致对磷脂酰肌醇-3-激酶（PIK3CA）抑制剂的耐药性。同样，在非小细胞肺癌患者中，MHC I类基因座的杂合性缺失使肿瘤细胞能够逃避免疫监视。相比之下，乘客突变不提供选择性优势，但被认为是已建立肿瘤中克隆多样性的主要来源。对12个原发和匹配转移样本以及112个早期II-III期患者原发肿瘤的基因组谱比较显示，BRAF和KRAS驱动突变的异质性导致结直肠癌患者中出现不同的共识分子亚型（CMS1-CMS4）。大多数CMS1患者样本富含BRAF突变，并显示KRAS突变减少，而CMS2和CMS3患者样本没有BRAF和KRAS突变。除了基因突变，基因表达谱（mRNA表达）的变化也会导致肿瘤内的异质细胞。通过对肝细胞癌（HCC）手术队列的全基因组和配对转录组进行测序，Zhai等人提出，由于多种转录组变异，II期癌症患者表现出高水平的表型ITH。在67名患者中，30%表现出混合转录组亚型，并显示出更具侵袭性的表型（上调细胞周期），而其余HCC患者则表现下调细胞周期和较低侵袭性表型。表观遗传修饰，如改变的DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑，在不改变DNA序列的情况下影响基因表达。对去势抵抗性神经内分泌前列腺癌（CRPC-NE）患者循环肿瘤DNA（ctDNA）的基因组和表观基因组谱分析显示，存在不同DNA甲基化谱的 distinct 群体。这些包括具有ASXL3和SPDEF基因高甲基化以及INSM1和CDH2基因低甲基化的亚克隆，这些基因也与激素治疗耐药有关。同样，由Marsolier等人进行的一项研究发现，在同一乳腺癌肿瘤内，抑制性组蛋白修饰H3K27me3的表达水平存在差异，其中H3K27me3减少的区域显示出对化疗的高耐受性。此外，在蛋白质水平上也观察到异质性，各种癌症表现出雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2等蛋白质的表达差异。例如，雌激素受体α（ERα）表达的异质性影响了子宫内膜癌患者的肿瘤分期、转移和预后。同样，参与细胞周期调控（如CDKN2A、TOP2A）和细胞增殖（如MYC、Ki-67）的蛋白质变化导致同一肿瘤内具有不同增殖、侵袭和耐药特性的亚克隆。

除了内在因素，外在因素如TME的组成部分（基质细胞、癌症相关成纤维细胞（CAF）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）以及趋化因子、细胞因子）影响免疫细胞活性，创造缺氧条件，改变血管系统，影响肿瘤细胞代谢，并帮助建立转移前微环境。这些组成部分共同与癌细胞相互作用，并在塑造肿瘤异质性方面发挥关键作用。氧气和营养的变化、免疫细胞的波动以及与基质细胞的动态相互作用允许选择具有独特适应性特征和代谢谱的亚群。在大多数癌症中，同一肿瘤内存在“热”和“冷”免疫微环境，分别以富含细胞毒性T细胞和免疫抑制调节性T细胞为标志。这些不同的微环境进一步影响肿瘤亚克隆的选择，这些亚克隆要么存活，要么逃避检测。同样，基质细胞如CAF分泌细胞外基质成分，如细胞因子和生长因子，通过旁分泌信号与肿瘤细胞通信，导致表型多样性。内在和外在因素都显著促进驱动转移的机制。

一个突出的生物学程序是上皮-间质转化（EMT），它使选定的上皮癌细胞获得间质特性，如增强的迁移能力和侵袭性，这对转移过程至关重要。在异质性肿瘤群体中，少数上皮细胞进行EMT的能力取决于转录因子（SNAIL、TWIST和ZEB）、蛋白质（N-钙粘蛋白、波形蛋白）、缺氧诱导因子（HIF）和细胞因子（如TGF-β）的表达。因此，这些罕见的转移细胞的选择受到ITH固有特性的强烈影响。

ITH也被认为在转移细胞内产生不同的表型。在一项特定研究中，Brown等人从SUM149PT人乳腺癌细胞系中分离出单细胞克隆，并使用多组学方法评估了癌细胞的转移能力。研究结果显示，癌细胞表现出EMT谱，包括描绘上皮（E）、中间EMT（EM1、EM2、EM3）和间质（M1、M2）表型的亚群。以CBFβ蛋白表达增加为特征的中间EMT细胞表现出比间质细胞高两到十倍的迁移和侵袭能力。此外，从注射SUM149PT细胞系的小鼠手术切除获得的肺转移揭示了不同的EMT表型，主要由中间EMT细胞贡献，而不是上皮和间质克隆。EM1形成微转移和宏转移的混合物，而EM2和EM3表型分别主要贡献微转移和宏转移。这项研究表明，EMT状态内的表型异质性可以影响转移进展和疾病结果。同样，ITH也被认为是转移患者预后不良和治疗失败的主要原因。肿瘤内的异质性创造了表现出不同药物敏感性的亚群，这些亚群逃避癌症治疗的效果，导致罕见的耐药细胞存活。ITH导致耐药的一个例子由一项研究说明，该研究评估了结直肠癌（CRC）患者中耐药细胞的动态。对二维患者类器官（2Do）的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和荧光激活细胞分选（FACS）揭示了异质细胞群体（POU5F1阳性和POU5F1阴性细胞）表现出POU5F1的差异表达。在体外对2Dos施用抗癌药物显示，在药物治疗结束时，与POU5F1阴性细胞相比，耐药的POU5F1阳性细胞比例更高。虽然POU5F1阴性细胞没有显示肝转移（0/4），但POU5F1阳性细胞表现出显著更高的转移潜力（4/4），同时Wnt/β-连环蛋白信号通路上调。用称为XAV939的Wnt/β-连环蛋白通路抑制剂治疗，显著降低了耐药POU5F1阳性细胞中的β-连环蛋白表达，并导致肿瘤缩小，这表明ITH在耐药性发展中的关键作用，并强调了靶向治疗在转移患者中的潜力。

尽管大量研究强调了肿瘤内异质性（ITH）在转移和耐药中的作用，但在理解ITH的分子机制及其对转移进展和治疗失败的突出贡献方面仍然存在显著差距。本综述旨在提高我们对转移性ITH的理解，解决该领域的技术挑战，并探索治疗转移的新途径。

1.1 肿瘤内异质性促进转移级联

ITH作为一种现象已在细胞系、动物模型和临床队列中得到证实，涉及各种转移性癌症，包括乳腺癌、肺癌、结直肠癌、肝癌、前列腺癌和黑色素瘤。例如，Fujino等人在结直肠癌患者的2D类器官中鉴定出两种具有不同转移潜力的 distinct 亚群（POU5F1低和POU5F1高细胞）。Peng等人在胰腺导管腺癌（PDAC）患者的肿瘤样本中观察到两种导管细胞类型（1型和2型导管细胞）表现出不同的转录组谱。这些细胞在基因表达、增殖率和迁移潜力上有所不同。1型导管细胞相对正常，存在于非癌和肿瘤组织中，而2型导管细胞是恶性的。Hapach等人在人转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中基于迁移能力分离出两种不同的循环肿瘤细胞亚群（弱迁移和高迁移）。一项关于CRC肝转移的计算研究揭示了五个不同的 de novo 肝转移亚型（LMS1-LSM5）集群，这些集群基于基因表达（如TP53、KRAS、NRAS和BRAF）表现出不同的EMT表型。这些研究强调了ITH在转移进展中的贡献，并强调了研究介导转移细胞中ITH的因素的必要性。

ITH可以在遗传、转录组、表观遗传和翻译后水平进行研究，所有这些都贡献于潜在的内在因素。在遗传水平上，驱动突变和乘客突变显著贡献异质性和转移。例如，Wang等人进行的一项研究分析了原发肺腺癌（LP）和匹配的脑转移（BM）中的基因组不稳定性。体细胞拷贝数改变（SCNA）负担分析显示，与LP肿瘤相比，BM中基因组不显著性和EGFR和SMAD4基因的上调（p=3.8e-05）。这表明LP中这些基因组不稳定性变异的持续积累导致了一些转移细胞的选择，这些细胞播种了骨转移。此外，发现BM患者的遗传ITH评分大于1的比例为77%，而LP患者为77%，这意味着遗传异质性在转移进展过程中扩大。因此，分析遗传ITH对于识别肿瘤内可能 contribute to 转移的罕见基因变异至关重要。在另一项研究中，Roper等人使用多组学方法分析了转移性胸部肿瘤（肺腺癌和胸腺癌）快速尸检样本，并观察到一个以高比例APOBEC3种系变异为特征的侵袭性表型。这些变异又由TP53基因突变和干扰素γ（IFN-γ）诱导的APOBEC表达信号上调，这也突出了肿瘤免疫微环境在驱动ITH中的作用。

除了基因突变，基因表达谱的异质性也会影响肿瘤细胞的转移潜力。例如，HER2乳腺癌的scRNA-seq揭示了一个转录因子（ZFP281），负责播散性癌细胞（DCC）中的两种突出表型。DCC中ZFP281的上调诱导了间质样休眠表型，导致早期肺转移生长。ZFP281和CDH11的下调导致DCC中侵袭性间质表型的丧失。同样，Winkler等人分析了来自乳腺癌患者来源异种移植（PDX）模型的原发肿瘤和匹配转移的单细胞转录组，显示肿瘤之间存在深刻的转录差异。基于EMT标记和参与免疫调节的基因的表达，原发肿瘤细胞进一步分类为低转移（EMT标记下调表达，高免疫细胞调节）、中间转移和高转移（EMT标记上调，低免疫细胞调节）。此外，Kaplan-Meier绘图仪显示，以5个标记基因（CD24、CRYAB、KRT15、CALML5和S100A2）上调为特征的中间EMT表型特别与较差的患者结局相关（p=1.2e-5）。因此，识别这种表型的转录组特征可能有助于识别潜在的新治疗靶点以防止转移发展。

表观遗传修饰是最常见的变化之一，影响肿瘤细胞以比遗传或转录变化更快的速度快速适应和进化。这些包括改变的DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑，这些在不改变DNA序列的情况下影响基因表达。一项在来自癌症基因组图谱（TCGA）和基因组资源信息数据库（GRID）的非洲前列腺癌患者数据中进行的计算研究显示，甲基化模式的显著差异随后导致主要通路如PI3K/AKT、MAPK和Wnt/β-连环蛋白通路的失调，促进转移。PTEN基因的高甲基化导致PI3K/AKT通路中PTEN沉默，促进癌细胞增殖和侵袭。MAPK通路中DNA高甲基化和组蛋白修饰诱导的基因沉默也导致转移扩散。此外，由表观遗传修饰驱动的 microRNAs（miRNAs）和长链非编码RNAs（lncRNAs）表达的改变 contribute to 非洲前列腺癌患者的侵袭性和不良预后。在另一项由Hua等人进行的研究中，调查了84名肺腺癌患者中SCNA和DNA甲基化的异质性。使用统计关联指数（APITH）量化了SCNA内的ITH程度，并使用Cox比例风险模型估计了生存风险。APITH指数指的是平均 pairwise 肿瘤内异质性指数。它是一个基于基因组数据（如SCNA）或表观遗传数据（如DNA甲基化谱）开发来量化肿瘤内ITH水平的统计指标。SCNA或甲基化的较高APITH值与癌症不良预后显著相关。Cox比例风险模型是一种统计方法，测量风险比（HR），表示因素（如生物标志物、基因表达）对特定事件（如转移、死亡）施加的风险。它还用于评估异质性（如甲基化模式）对患者生存结局的影响。APITH指数在显示高水平SCNA和甲基化谱的患者中较高，表明高水平的ITH。此外，Cox比例风险模型表明，显示以显著改变的CpG岛甲基化表型为特征的较高甲基化谱的患者与远处转移风险（HR=1.35，95% CI 1.07-1.72，p=0.012）和较差总生存（HR=1.27，95% CI 1.05-1.55，p=0.016）相关，突出了表观遗传修饰在驱动转移潜力中的关键作用。

蛋白质表达是基因翻译的最终目标，被认为是ITH的关键来源。鉴于蛋白质是所有细胞通路的最终效应器，它们通常作为治疗的关键靶点。因此，理解蛋白质表达的异质性及其在转移中的作用至关重要。基于蛋白质标记的表达，在人转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中获得了弱迁移和高迁移的循环肿瘤细胞。Transwell迁移实验证实，这些群体表现出不同的转移潜力。弱迁移亚群显示出较高的转移能力，并以称为E-钙粘蛋白的蛋白质耗尽为特征，而高迁移亚群显示出较低的转移能力，并以较高的E-钙粘蛋白表达为标志。这突出了差异蛋白质表达在影响肿瘤细胞迁移和转移能力中的作用。在一项综合研究中，观察到与前列腺癌相比，骨转移（BM）中参与细胞周期进展的蛋白质存在高度异质性。基于差异蛋白质表达，骨转移进一步分为两个不同的表型亚组。BM 1组表现出较高水平的前列腺特异性抗原（PSA）和较低水平的小染色体维持蛋白3（MCM3），而BM 2组肿瘤富含细胞增殖过程，如DNA复制、有丝分裂、mRNA加工，并显示高MCM3和低PSA表达。Kaplan-Meier分析暗示，具有BM2样转移的患者在首次治疗后的生存时间比BM1样组短，表明转移性肿瘤中的蛋白质异质性对前列腺癌的治疗干预至关重要。除了内在因素，TME的作用在驱动ITH和疾病进展中至关重要。

TME作为一个动态生态系统，在肿瘤生长过程中经历显著变化，其中之一包括机械调节。它指的是由细胞外基质刚度改变驱动的TME机械特性的变化，是ITH的强大驱动因素。ECM的刚度又由ECM组成部分（包括胶原和糖萼）的不均匀分布和交联决定，导致TME内的空间异质性。增加的ECM刚度是由于YAP/TAZ，它们是细胞可塑性的关键转录调节因子。YAP（Yes相关蛋白）和TAZ（带有PDZ结合基序的转录共激活因子）是作为转录共激活因子功能的蛋白质，是Hippo信号通路的主要下游效应器。YAP/TAZ易位到细胞核并驱动参与增殖、存活、EMT和干性的基因表达，导致出现具有不同侵袭和转移潜力的表型多样亚群。由Barai等人进行的一项研究表明，糖萼组成的变化通过YAP/TAZ激活改变了机械调节效率。糖萼组成变化的细胞，特别是糖蛋白Mucin-1（MUC1）导致YAP/TAZ激活改变， resulting in 具有不同基因表达谱和迁移能力的亚群。特别是，具有中间水平MUC1表达的细胞与最高的运动性和侵袭性相关，表明TME的生化和物理特性都可以影响转移进展。除了机械调节，TME动力学也可以影响治疗耐药。由Zou等人进行的一项研究调查了抗PD-1/L1免疫检查点治疗在转移性乳腺癌部位的效果。治疗后，在肝和脑转移中发现较高比例的免疫耐药细胞，这些细胞归因于免疫TME。免疫转移环境重编程了免疫抑制细胞，如FOXP3+调节性T细胞、LAMP3+耐受性树突状细胞在肝和脑转移中 compared to 其他部位，导致化学耐药。在黑色素瘤-PDX中的体内同位素示踪分析揭示了表现出不同乳酸水平和单羧酸转运蛋白1（MCT1）的群体，影响转移潜力。高效转移细胞显示较高水平的MCT1和乳酸摄取，而低效转移细胞显示MCT1抑制和乳酸摄取减少。在小鼠模型中敲低MCT1导致转移负担减少，表明MCT1也可能成为癌症治疗的潜在靶点。同样，一项关于结直肠癌肝转移的研究揭示了五个不同的 de novo 肝转移亚型（LMS1-LSM5）集群，这些集群基于基因表达（TP53、KRAS、NRAS和BRAF）表现出不同的EMT表型。与其他研究结果相反，这些研究将高水平的异质性与不良预后相关联，主成分分析证实，LMS1是最不异质的亚型，表现出上皮表型，并与LMS患者较差的生存结局相关。这强烈表明ITH对转移进展的影响取决于癌症类型以及来自TME的外部信号。虽然LMS2、LMS3和LMS4亚群表现出 transit 放大表型，但LMS5是唯一的间质样亚型，显示高水平的转录组异质性，这又受到来自TME的基质和免疫细胞浸润的影响。因此，除了基因突变，肿瘤细胞与周围TME之间的相互作用在驱动表型异质性和转移患者结局方面同样重要。

1.2 肿瘤内异质性在治疗耐药中的意义

耐药是一种复杂、多方面的现象，肿瘤细胞通过它发展出对癌症治疗的耐受性。它是导致癌症复发的主要因素，也是癌症相关死亡的主要原因之一。耐药分为两种类型：内在耐药和获得性耐药。内在耐药是癌细胞由于驱动基因突变以及TME的选择压力而无法对治疗作出反应。另一方面，获得性耐药发生在肿瘤细胞 upon 长期暴露于药物时发展出对治疗的耐药性，最终导致复发。肿瘤细胞进入静止期以逃避化疗，并随着时间的推移发展出耐药性。导致两种耐药类型的主要机制包括药物外排泵的激活、质膜中转运蛋白结构的改变、活性氧（ROS）诱导的缺氧条件、改变的葡萄糖代谢和肿瘤相关巨噬细胞的旁分泌信号增加。外排泵是质膜蛋白质，参与药物的主动转运 outside 细胞，从而降低细胞内药物浓度。外排泵如ATP结合盒转运蛋白在癌细胞中过表达，并 actively 泵出化疗药物，使其无法到达细胞内靶点，通常导致耐药。溶质载体基因（SLC）的突变改变了癌细胞膜中转运蛋白的结构，导致药物摄取减少。例如，OCT1的表达，溶质载体家族的一员，与HCC患者的转移进展和生存相关。在晚期HCC患者中，编码转运蛋白OCT1的基因SLC22A1的突变导致靶向药物如索拉非尼的摄取减少，导致治疗失败。

改变的葡萄糖代谢在介导内在和获得性耐药中起关键作用。癌细胞利用糖酵解进行能量生产，即使在缺氧条件下也导致葡萄糖摄取增加和乳酸生产。这种代谢重编程导致在压力条件下快速增殖和存活，包括暴露于化疗药物。例如，糖酵解酶如己糖激酶2（HK2）和乳酸脱氢酶A（LDHA）的上调增强了肿瘤细胞在缺氧条件下的存活和耐受性，导致化学耐药。在一项研究中，用紫杉醇处理的三阴性乳腺癌（TNBC）细胞系显示HK2富集和向糖酵解的代谢转换。紫杉醇诱导了持续的糖酵解状态，导致氧化磷酸化减少和化学耐药。同样，他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞系（MCF-7/TAM-R和T47D/TAM-R）显示LDHA水平升高，这已知通过Beclin诱导的促存活自噬驱动对他莫昔芬的耐药。研究人员证明，抑制LDHA恢复了凋亡并逆转了对