胆固醇耗竭通过U18666A和甲基-β-环糊精增加脑微血管内皮细胞小分子通透性

本研究针对胆固醇代谢异常疾病（如尼曼匹克病C1型）中血脑屏障功能紊乱的机制，利用人多能干细胞分化的脑微血管内皮细胞模型，通过U18666A（NPC1蛋白抑制剂）和甲基-β环糊精（MβCD）诱导胆固醇耗竭，发现胆固醇缺失会破坏紧密连接蛋白连续性（occludin连续性降低13%，claudin-5降低8%及蛋白水平下降53%），导致跨内皮电阻（TEER）显著下降（75–93%）和小分子渗透性显著增加（9–20倍）。研究证实羟丙基-β环糊精（HPβCD）可逆转上述屏障损伤，提示靶向内皮细胞胆固醇稳态可能为NP-C1等疾病提供新型治疗策略。

　　

血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）是中枢神经系统的重要保护结构，主要由脑微血管内皮细胞（Brain Microvascular Endothelial Cells, BMECs）通过紧密连接（Tight Junction, TJ）蛋白（如claudin-5、occludin、ZO-1）密封形成，严格控制物质从血液进入脑组织。BBB的破坏与多种神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化及中风等相关。然而，在一些罕见的遗传性胆固醇代谢疾病，例如尼曼匹克病C1型（Niemann-Pick Disease Type C1, NP-C1）中，BBB是否受损以及其机制如何，至今仍不明确。

NP-C1是一种常染色体隐性遗传病，主要由NPC1基因突变引起。该基因编码的蛋白负责将胆固醇从晚期内体/溶酶体运输至细胞膜及其他细胞器。NP-C1患者细胞内胆固醇和糖鞘脂积累，而质膜胆固醇却显著减少，导致进行性神经功能障碍，如小脑共济失调、智力障碍、癫痫等，最终危及生命。尽管胆固醇在维持细胞膜结构和功能中起核心作用，并且胆固醇耗竭已被证明可影响上皮细胞屏障，但关于胆固醇缺失如何影响人源脑微血管内皮细胞屏障功能的研究仍较为缺乏。

为此，研究人员Alisa Morss Clyne团队在《Annals of Biomedical Engineering》发表论文，深入探讨了胆固醇耗竭对血脑屏障完整性的影响及其潜在机制。他们提出假设：胆固醇耗竭会破坏紧密连接蛋白的连续性，从而增加内皮通透性。为验证这一假说，研究团队利用人诱导多能干细胞（human-induced pluripotent stem cells, hiPSCs）定向分化为脑微血管内皮细胞（hiBMECs），并采用药物U18666A（NPC1抑制剂）和甲基-β环糊精（MβCD）分别模拟NP-C1病理状态和急性胆固醇耗竭模型，系统评估了跨内皮电阻（TEER）、不同大小分子渗透性、紧密连接连续性及蛋白表达变化，并探索了羟丙基-β环糊精（HPβCD）和糖代谢抑制剂的干预效果。

本研究主要采用了以下关键技术方法：1）人多能干细胞定向分化为脑微血管内皮细胞（hiBMECs）；2）通过Amplex Red试剂盒和perfringolysin-O（PFO）染色分别定量总胆固醇和膜胆固醇分布；3）跨内皮电阻（TEER）测量与荧光分子渗透性实验；4）高通量细胞连接连续性分析软件JAnaP评估紧密连接形态；5）蛋白质免疫印迹（Western Blot）和实时定量PCR（RT-PCR）检测紧密连接蛋白表达与转录水平；6）糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）处理以干预细胞代谢。

研究结果如下：

U18666A和MβCD降低hiBMEC胆固醇并损害屏障完整性

使用10μM U18666A处理48小时后，细胞总胆固醇下降近25%，膜胆固醇（通过PFO-488染色评估）下降超过50%，且胆固醇重新分布至核周区域。TEER显著降低，降幅达88%。类似地，3 mM MβCD处理3小时即可使总胆固醇降低60%，膜胆固醇几乎完全消失，TEER下降至初始值的8%。这些结果表明胆固醇耗竭直接导致屏障功能受损。

hiBMEC胆固醇耗竭增加小分子渗透性

通过不同分子量示踪剂（钠荧光素，376 Da；4 kDa、10 kDa、70 kDa右旋糖酐）的渗透性实验发现，U18666A和MβCD处理均显著增加小分子（如钠荧光素）的渗透性（分别提高9倍和20倍），而对10 kDa和70 kDa大分子渗透性无显著影响。说明胆固醇耗竭导致的屏障破坏具有尺寸选择性，主要影响小于4 kDa的小分子。

hiBMEC胆固醇耗竭降低紧密连接连续性

利用JAnaP软件对细胞连接进行形态定量分析显示，U18666A处理使occludin连续性降低13%，claudin-5连续性降低8%，而ZO-1连续性未发生显著改变。表明胆固醇耗竭对不同的紧密连接蛋白影响具有特异性。

U18666A降低hiBMEC Claudin-5蛋白，HPBCD可阻止该效应

Western Blot结果显示，U18666A处理导致claudin-5蛋白水平下降53%，而occludin、ZO-1以及VE-cadherin及其磷酸化形式均未发生显著变化。共处理HPβCD可阻止claudin-5蛋白的减少，但CLDN5的mRNA水平未发生改变，提示U18666A可能通过转录后机制调控claudin-5。

HPBCD维持hiBMEC屏障完整性和连续紧密连接

与单用U18666A相比，HPβCD共处理显著改善TEER、钠荧光素渗透性及claudin-5连续性，使其接近正常水平。水溶性胆固醇补充实验也证实，恢复膜胆固醇可有效阻止U18666A引起的TEER下降。

糖酵解抑制阻止U18666A引起的屏障完整性丧失

先前研究发现U18666A处理可提高hiBMEC糖酵解活性。本研究显示，使用糖酵解抑制剂2-DG处理可显著降低乳酸分泌，并部分阻止U18666A引起的TEER下降和渗透性增加。表明糖代谢重编程（特别是糖酵解增强）可能参与胆固醇耗竭所诱导的屏障功能障碍。

本研究通过多种技术手段证实，胆固醇耗竭（无论是通过U18666A模拟NP-C1病理，还是通过MβCD急性剥夺）均会导致人脑微血管内皮细胞屏障功能受损，主要表现为紧密连接蛋白claudin-5和occludin的连续性破坏和claudin-5蛋白表达下调，进而增加对小分子物质的通透性。机制上，这种屏障破坏可能与胆固醇缺失后claudin-5从脂筏中位移、以及糖酵解活性上升有关。

值得注意的是，潜在治疗药物HPβCD通过促进溶酶体胆固醇释放至膜结构，有效逆转了上述屏障损害，这为NP-C1及其他胆固醇代谢异常疾病（如Smith-Lemli-Opitz综合征）的治疗提供了新思路。但同时，屏障功能的恢复也可能影响药物向脑部的递送，这为后续治疗策略的设计带来新的考量。

该研究不仅深化了对血脑屏障在胆固醇相关疾病中作用的理解，也突出了脑微血管内皮细胞作为治疗靶点的重要性，为未来开发针对NP-C1的屏障导向疗法奠定了坚实基础。