ZNF750功能缺失通过诱发角质形成细胞炎症反应及免疫细胞浸润驱动自发性银屑病样皮肤炎症

本研究揭示了上皮特异性转录因子ZNF750在维持皮肤稳态中的关键作用。通过构建诱导性角质形成细胞特异性Znf750敲除小鼠模型，研究人员发现ZNF750功能缺失会导致表皮增殖-分化失衡，诱发CCL20、IL23A等促炎因子表达，并引起多种免疫细胞浸润，最终驱动自发性银屑病样皮肤炎症。该研究为理解ZNF750相关银屑病样疾病的发病机制提供了重要依据。

　　

在皮肤科学领域，表皮角质形成细胞不仅构成机体与外界环境之间的物理屏障，还积极参与皮肤炎症的启动、进展和维持过程。锌指蛋白750（ZNF750）作为上皮特异性转录因子，在分化中的角质形成细胞中表达，对细胞终末分化至关重要。人类遗传学研究已发现，ZNF750序列变异会导致银屑病样皮肤疾病，但其具体机制尚不明确。由于胚胎期Znf750缺失会导致新生儿致死，阻碍了对其在成年皮肤稳态中功能的深入研究。

为解决这一科学问题，来自以色列本-古里安大学的Hilla Levi、Topaz Alfer、Roi Gazit和Idan Cohen研究团队在《JHEP Reports》上发表了一项创新性研究。他们通过构建诱导性角质形成细胞特异性Znf750敲除小鼠模型，首次揭示了ZNF750在成年小鼠表皮中的功能缺失会自发引起严重的银屑病样皮肤炎症。

研究人员主要应用了以下几种关键技术方法：使用K5-Cre^ERT2;Znf750^flox/flox基因工程小鼠模型，通过局部应用4-羟基他莫昔芬（4-OHT）诱导成年小鼠表皮特异性基因敲除；采用免疫荧光染色技术分析表皮分化标志物和免疫细胞浸润；通过RT-qPCR检测炎症因子表达；使用特异性抗体标记各种免疫细胞亚群。

INTRODUCTION

表皮是不断更新的复层上皮，位于机体与环境的交界处。角质形成细胞作为表皮的主要细胞类型和结构成分，维持着防止水分流失、阻止有害病原体入侵的保护性屏障。表皮分化 disruption 是特应性皮炎、银屑病和鳞状细胞癌等常见皮肤疾病的特征。除了形成和维持物理屏障的被动作用外，角质形成细胞还作为免疫反应的调节剂发挥主动作用。ZNF750是终端表皮分化的重要转录调节因子，其在人类的截短功能缺失序列变异会导致银屑病样皮肤疾病。

RESULTS AND DISCUSSION

为了诱导表皮特异性删除Znf750，研究人员将Znf750 floxed小鼠与K5-Cre^ERT2小鼠杂交，通过在出生后第39天（P39）开始局部应用4-OHT诱导删除。 dorsal皮肤样本在P60采集，RT-qPCR证实了Znf750编码外显子的有效删除。

令人惊讶的是，Znf750 iKO小鼠在两周内自发出现红斑和鳞屑样皮肤表现。组织学检查显示Znf750 iKO小鼠毛囊变形、表皮棘层增厚伴角化过度和角化不全。研究人员观察到基底層标志物 keratin 14向基上层扩展，Znf750 iKO表皮中增殖标志物Ki67大量表达。与对照小鼠中仅限于毛囊的正常表达不同，增生相关标志物keratin 6（已知在屏障破坏和疾病皮肤 condition 中上调）在整个Znf750 iKO表皮中被诱导表达。这些数据表明表皮ZNF750缺失通过限制角质形成细胞增殖导致表皮稳态受损。

此外，Znf750缺陷的角质形成细胞诱导了Ccl20 mRNA的表达，这在银屑病皮肤中已知被诱导，并募集免疫细胞到损伤部位以启动或放大皮肤炎症。分析还揭示了Il23a mRNA在Znf750缺陷的角质形成细胞中的强烈诱导，这在银屑病皮肤中也已知被诱导，并在刺激T辅助17（Th17）细胞产生白细胞介素（IL）17驱动的促炎环境中起重要作用。这些发现表明ZNF750需要抑制角质形成细胞中的促炎途径。

鉴于明显的红斑和组织学改变，以及促炎因子的诱导，研究人员接下来检查了Znf750 iKO皮肤的炎症 profile。对泛造血标志物CD45的免疫荧光染色显示，与对照皮肤相比，Znf750 iKO皮肤中CD45⁺细胞丰富。这些浸润的免疫细胞包括CD11b⁺髓系细胞，包括主要位于角化不全区域的CD11b⁺LY6G⁺中性粒细胞，定位到真皮 compartment 的CD4⁺ T细胞，以及在Znf750 iKO小鼠表皮中富集的CD8⁺ T细胞。Znf750 iKO小鼠中富集的其他免疫细胞亚群包括CD11c⁺树突状细胞和CD317⁺浆细胞样树突状细胞。这些免疫学变化伴随着Znf750 iKO真皮中的血管扩张。

研究表明，成年小鼠表皮中Znf750删除会导致自发性银屑病样皮肤炎症的发展。值得注意的是，该研究侧重于Znf750 iKO小鼠在ZNF750消融后不久的主要皮肤组织病理学特征。进一步评估皮肤炎症是否持续较长时间，以及评估关节性、结肠炎、肝炎和葡萄膜炎等皮肤外表现（在具有系统受累的银屑病疾病中可见）将有助于进一步阐明这种遗传模型与真正银屑病的相似程度。最后，评估IL17/IL23轴在Znf750 iKO小鼠银屑病样皮肤炎症中的参与，包括对病变皮肤和周围淋巴器官中关键途径细胞因子的时间过程分析，以及确定IL17和/或IL23阻断是否可以减轻银屑病样特征，将有助于确定Znf750 iKO小鼠中观察到的炎症是否依赖于典型的银屑病途径。

MATERIALS AND METHODS

本研究中使用的小鼠饲养于本-古里安大学动物设施单元，保持在特定病原体（SPF）条件下。Znf750^flox/flox小鼠 strain 通过用LoxP位点侧接外显子2-3的编码区产生，通过同源重组引入遗传C57BL/6背景。Krt5-Cre^ERT2小鼠从Jackson Laboratories获得。为了局部诱导成年小鼠表皮中的Znf750删除，将4-OHT应用于小鼠背部皮肤（100 μL of 10 mg/μL），从出生后第39天（P39）的第二个退行期开始，然后每两天重复一次，共四次处理。背部皮肤样本在P60收集用于分析。

背部皮肤组织在P60从Znf750 iKO和对照小鼠收集，嵌入组织冷冻培养基中，并使用冷冻切片机切成10μm sections。载玻片然后在室温下用4%多聚甲醛固定10分钟，用1×PBS洗涤，并在IF blocking solution中于4°C孵育过夜。一抗稀释在IF blocking solution中，室温孵育1小时。载玻片然后用PBST洗涤三次，每次5分钟。随后与二抗（均稀释1:1000在IF blocking solution中）室温孵育1小时。为了可视化细胞核，载玻片用PBST洗涤并用DAPI 1:1000在1×PBS中复染5分钟。使用正置显微镜 with ×4 or ×10 objectives 对载玻片进行成像。

对照和Znf750 iKO小鼠在P60的背部皮肤被剥离，并刮掉脂肪层。组织用1×PBS洗涤一次，并在0.25%胰蛋白酶中于4°C孵育过夜。孵育后，刮下表皮细胞，向细胞 suspension 中加入25 mL E-media，并将 suspension 依次通过100 μm和40 μm过滤器。然后用冷1×PBS洗涤细胞两次，用于RNA纯化。

Znf750 iKO和对照的表皮细胞从小鼠在P60分离，并在350 μL Trizol中室温孵育10分钟。使用TriRNA Pure Kit按照制造商的说明纯化总RNA。使用AzuraQuant cDNA Synthesis Kit从总RNA反转录cDNA。使用LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix在LightCycler 480 instrument上通过RT-qPCR分析样品。每个样品使用三个技术重复。样品标准化为Peptidylprolyl isomerase b（Ppib）mRNA水平，并使用2^-ΔΔCT方法确定相对mRNA表达水平。

该研究通过严谨的实验设计证实了ZNF750在维持表皮稳态和抑制皮肤炎症中的核心作用。研究人员发现，表皮特异性缺失ZNF750会迅速引发银屑病样皮肤病变，表现为表皮增生、分化异常、促炎因子上调和多种免疫细胞浸润。这些发现不仅为理解ZNF750相关银屑病样疾病的发病机制提供了重要见解，也强调了角质形成细胞在炎症性皮肤疾病 pathogenesis 中的主动作用。该研究建立的遗传小鼠模型为未来研究银屑病发病机制和测试新型治疗方法提供了有价值的平台，特别是对于携带ZNF750序列变异的患者群体具有重要的临床意义。