免疫调控基因表达谱揭示甲状腺未分化癌（ATC）与乳头状癌（PTC）共存成分的差异及其在肿瘤进展中的潜在作用

为解决甲状腺癌中免疫调控机制不明，特别是在侵袭性亚型如未分化癌（ATC）和低分化癌（PDTC）中的角色，研究人员开展了一项关于ATC与PTC共存成分的免疫相关基因和miRNA表达谱研究。通过NanoString技术和miRNA分析，发现ATC相较于PDTC具有更高的免疫基因表达，并鉴定出MAP3K1等关键基因和MAPK信号通路在肿瘤进展中的潜在作用，为生物标志物开发和免疫治疗策略提供了新见解。

　　

甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，其中甲状腺滤泡细胞通过多步骤过程发生转化，形成从高分化类型（如乳头状癌（PTC）和滤泡癌（FTC））到高级别非未分化癌（包括低分化癌（PDTC）和高级别分化癌）以及未分化癌（ATC）等多种组织学类型。PDTC和ATC虽然比高分化癌更罕见，但临床更具侵袭性，中位生存时间分别仅为5年和6个月。过去40年的多项研究在大量PDTC和ATC病例中识别出高分化成分，表明存在从高分化向低分化或未分化形式进展的演化路径，其中PTC成分是最常与ATC相关的组织型。在分子水平上，从高分化癌到PDTC和ATC，肿瘤突变负荷逐渐增加。BRAF^V600E和其他分子驱动因素（如RAS突变或RET和NTRK重排）通常与PTC相关，这些改变在PDTC和ATC中以相似频率出现。此外，高级别癌中发生额外突变（包括TERT启动子和TP53突变），这些突变被认为在肿瘤进展中起主要作用。Ragazzi等人的研究强调，共存PTC和ATC成分具有共同的早期驱动（BRAF、PIK3CA、RAS）和晚期（TERT启动子）突变，而TP53突变几乎仅发生在ATC成分中，这表明非基因组机制可能共同参与甲状腺癌的肿瘤进展相关机制。其中，研究肿瘤免疫微环境是揭示高分化癌向低分化和未分化癌进展机制的一个重要方面。Giannini等人展示了组织型特异性的免疫相关基因特征，在ATC中显著上调。此外，在大多数分析的ATC病例和约一半PTC的肿瘤微环境中，观察到巨噬细胞和CD8⁺ T细胞的浸润，并具有功能耗竭特征（即所谓“热”肿瘤）。有趣的是，PDTC和部分PTC显示出较低水平的免疫相关基因表达和低至无的免疫细胞浸润，由非炎症性CD8⁺ T细胞增强（将这些病例称为“冷”肿瘤）。此外，在ATC和PTC中，免疫检查点（即PDL1、PDL2、PD1、LAG-3、TIM3、PVR和TIGIT）的上调抑制了免疫反应。

基于此，本研究旨在（i）使用nCounter? PanCancer Immune Profiling Panel研究联合肿瘤中ATC和PTC成分的差异免疫相关基因表达谱；（ii）评估两种成分中检查点抑制剂PD-L1的状态；以及（iii）评估miRNA是否可能干扰免疫相关基因表达特征的调控。

为了开展研究，研究人员从意大利都灵和奥尔巴萨诺的学术医院病理档案中选取了2001年至2021年间一系列与PTC相关的ATC病例。经过苏木精和伊红染色切片审查，最终有12例具有足够PTC和ATC成分残留材料的病例符合后续分子和免疫组化分析条件。每个病例的ATC和PTC成分分别进行显微切割和处理。此外，还检索了之前已报道的9例与PTC相关的PDTC病例的分子数据作为对照组，以比较从PTC进展而来的病例中ATC和PDTC成分的基因表达谱。临床和病理参数包括组织学类型（更新至WHO第5版分类）、TNM分期（更新至AJCC第8版）、多灶性、肿瘤直径、血管侵犯存在、坏死存在、手术切缘状态、甲状腺外扩展、肿瘤包膜存在、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和随访状态被纳入匿名数据库。TILs评分根据乳腺癌中临床验证的评分系统，在10个随机视野下评估，分为低（<10%）、中（10-49%）和高（>50%）三组。所有病例在开始前均去标识化，并由未参与研究的人员编码，所有数据均匿名访问。研究经当地伦理委员会批准，并遵循《赫尔辛基宣言》原则。鉴于研究的回顾性性质、数据匿名化且对患者护理无影响，无需特定书面知情同意。

基因表达分析使用nCounter? PanCancer Immune Profiling Panel（NanoString Technologies）测量肿瘤微环境中免疫基因的相对表达水平。详细步骤参见Metovic等人（2020）。还考虑了nSolver高级分析中的通路评分，通路评分将每个样本的基因表达谱压缩为一小组通路评分，使用每个基因集数据的第一个主成分，使得分数增加对应大多数基因表达增加。设定p值0.05以查看结果并计算相对通路评分。12例中有8例具有足够FFPE材料的ATC和PTC成分额外进行了miRNome分析。使用miRNase isolation FFPE Kit（Qiagen）从组织标本中分离总RNA（包括miRNA）。每个样本40 ng总RNA使用miR-CURY LNA RT Kit（Qiagen）进行反转录。实时PCR使用ABI 7900HT仪器和miRCURY LNA miRNA miRNome PCR Panel（Human panel I+II, V5）进行。使用GeneGlobe上的免费miRNA PCR Array Data Analysis工具分析数据。免疫组化使用Ventana BenchMark AutoStainer自动平台和抗PD-L1小鼠单克隆抗体（22C3, 1:50稀释, Dako Agilent）进行。PD-L1 cutoff设定为1%的阳性肿瘤细胞（膜模式）。基于先前包括测试其临床价值的研究，选择肿瘤比例评分（TPS）。PDTC病例的PD-L1状态已在先前相同实验条件下测试。每个免疫组化运行均包含适当的阳性和阴性对照。统计分析使用GraphPad Prism v8软件进行Mann-Whitney检验，比较ATC和PTC成分的基因表达谱，p值<0.05视为显著。对于miRNA分析，使用Morpheus软件进行聚类分析。使用mirDIP软件测试NanoString分析中鉴定的显著基因是否由显著miRNA靶向。使用STRING数据库和Cytoscape软件通过KEGG通路分析识别由失调miRNA损害的通路。

研究结果方面，临床和病理特征显示，12例ATC伴有PTC成分的病例中，患者平均年龄73.8岁，多数处于pT4期（11/12）和淋巴结阳性（10/12）。肿瘤大小平均7 cm，无包膜（12/12），常见多灶性（9/12）、甲状腺外扩展（11/12）、血管侵犯（12/12）、坏死（10/12）和阳性切除边缘（10/12）。坏死仅见于ATC成分。PTC成分主要为经典亚型（7例），其余为浸润性滤泡变体（4例）或 hobnail亚型（1例）。具有hobnail特征的PTC病例有6个核分裂象/2 mm2，符合高级别分化甲状腺癌成分。其他PTC成分未见核分裂象≥5/2 mm2或坏死。两个经典型病例有局灶hobnail特征（<10%肿瘤群体）。ATC主要病理模式为无鳞状分化的上皮样（4例）、鳞状（3例）、梭形（3例）、具有横纹肌样特征的多形性（1例）和巨细胞型（1例）。TILs在PTC和ATC区域比较显示，多数病例无显著差异，5例低评分，5例中评分，两例显示PTC成分低至中和高至中评分与ATC比较。所有但有1例有随访信息，所有信息病例均死于疾病，平均进展时间小于6个月，平均总生存期小于10个月。

免疫相关基因表达在ATC和匹配PTC成分中的分析显示，配对分析中大多数基因表达相似，但单基因分析发现少数基因有统计学显著差异表达（p<0.001）。具体地，5个基因（MAP3K1、PRKCD、CYFIP2、BLNK和EPCAM）在ATC中下调，6个基因（RIPK2、ITGB1、ITGA5、CCL3L1、PLAUR和TICAM2）上调。有趣的是，11个基因中9个的失调模式在几乎所有样本中一致。随后，使用nSolver细胞类型分析调查ATC与PTC对应成分的免疫浸润谱。基于生物学功能聚类基因，ATC成分中与巨噬细胞类型（p=0.01）和CD45阳性免疫细胞（p=0.04）相关的基因表达增加。在NK/CD56dim细胞、细胞毒性细胞、树突状细胞、Treg、T细胞、肥大细胞、中性粒细胞、耗竭CD8、B细胞、Th1细胞和CD8 T细胞相关免疫通路方面，ATC与PTC成分无显著差异。此外，关于不同细胞通路的基因表达水平，注意到ATC成分中趋化因子（p=0.04）、补体（p=0.02）、细胞因子（p=0.03）、白细胞介素（p=0.02）、NK细胞功能（p=0.03）、粘附（p=0.01）、细胞周期（p=0.003）、病原体防御（p=0.02）和调控（p=0.04）的表达增加。两种成分在抗原加工、B细胞功能、细胞功能、细胞毒性、白细胞功能、巨噬细胞功能、衰老、T细胞功能、Toll样受体（TLR）、TNF超家族和转运蛋白功能通路方面无显著调控差异。基因表达数据与表1所列临床病理参数无相关性，可能由于变量在系列中分布不平衡。比较基因表达谱和TILs存在及程度（以ATC成分结果作为参考）也无相关性。还进行了亚组分析，比较不同病理亚型或模式（PTC成分经典型vs其他，ATC成分上皮样/鳞状vs梭形/多形性/巨细胞），但由于亚组样本量有限，未证明差异谱。

PD-L1表达方面，比较ATC和PTC成分，未观察到CD274基因表达差异。然而，免疫组化显示，多数病例中ATC成分PD-L1阳性增加（7/12例），包括4例PTC成分完全阴性但ATC区域阳性。TILs评分与PD-L1表达无统计学显著关联。PDTC病例中，3/9（33.3%）肿瘤PD-L1阳性。

比较ATC和PDTC成分（均与PTC相关）的免疫基因表达谱显示，ATC中161/730基因上调（p<0.01），17/730基因下调（p<0.01）。上调基因中19个具有强统计显著性（p<0.0001），包括与M2巨噬细胞功能、TIM-3免疫检查点、白细胞介素、免疫细胞调控和功能、B细胞活化、T细胞和B细胞分化、干扰素和核因子κB（NF-κB）通路、TLR信号、补体通路、细胞周期、细胞功能和粘附相关的基因。下调基因中，两个最显著（p<0.0001）的RORC和PLA2G6分别涉及细胞功能和炎症调控。随后评估了ATC和PDTC间差异基因表达谱是否依赖于PD-L1表达状态。PD-L1阳性ATC与PD-L1阳性PDTC的免疫相关基因表达谱分析显示，ATC中730基因中CD163、CD40、CKLF和ITGA5上调（p<0.01）。相反，未观察到显著下调基因。比较PD-L1阴性ATC与PD-L1阴性PDTC，仅观察到ATC组中RORC和PLA2G6下调（p<0.05）。

miRNA分析在ATC和PTC成分中，8对PTC和ATC成分的全局miRNA表达无监督聚类分析清楚显示，肿瘤组织样本基于组织学类型而非来源病例分离。PTC和ATC样本不同病理亚型或模式在聚类中异质分布。54个miRNA在PTC与ATC样本中显著差异调控，所有54个miRNA在PTC样本中下调，表明在ATC肿瘤样本中显著过表达。KEGG通路分析描述了PTC和ATC样本中差异表达miRNA可能失调的主要通路。值得注意的是，MAPK信号是可能调控的第二最相关通路，该通路中24个基因至少受54个失调miRNA中的一个靶向。此外，6/54失调miRNA（即hsa-let-7g-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-21-3p）特异性靶向MAP3K1基因。

讨论部分，本研究使用基于NanoString的基因表达和miRNA全局分析调查了与PTC成分相关的ATC病例的转录特征。观察到仅11个超过700个免疫相关基因与两种癌对应成分相比显著失调。这种基因表达谱的轻微差异可能反映了乳头状成分固有的侵袭性，已经致力于进展和去分化。然而，差异表达基因在多数病例中显示相似谱，表明它们的上或下调代表潜在的生物学有意义特征。此外，TILs的组织病理学评估在比较同一肿瘤内PTC和ATC成分时无显著差异，而是病例特异性，且与免疫相关基因特征无直接关联。ATC成分中6个上调基因中，RIPK2（受体相互作用蛋白激酶2）据报道在一些癌症类型中高表达，如膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润癌和甲状腺癌。RIPK2不仅在炎症和免疫疾病中起重要作用，还涉及肿瘤侵袭和转移，并促进免疫细胞浸润，尤其在甲状腺癌、肾透明细胞癌和睾丸生殖细胞肿瘤中。Song等人证明RIPK2与一些免疫检查点标志物（如PD-1、PD-L1、CTLA-4和TIGIT）表达正相关，表明RIPK2表达与免疫逃逸策略相关。ITGA5和ITGB1（αV和β1整合素）介导细胞粘附并促进肿瘤细胞生存、增殖和迁移，从而促进肿瘤进展和转移。整合素αVβ1的异常上调在几种人类恶性肿瘤中观察到，并与不良预后密切相关。CCL3L1编码一种促炎趋化因子，除了参与免疫细胞趋化外，该分子上调与膀胱高级别肌浸润尿路上皮癌中PD-L1表达相关，表明其在肿瘤免疫耐受和肿瘤进展中的潜在作用。PLAUR编码尿激酶纤溶酶原激活物受体（uPAR）。一些数据显示，在侵袭性甲状腺形式中，与高分化癌相比，uPAR表达有增加趋势。Li C.W.等人证明PLAUR和其他三个免疫相关基因（PRKCQ、PSMD2和BMP7）在甲状腺癌去分化过程中起重要作用。相应地，他们观察到ATC中PLAUR相较于PTC上调。此外，该分子与PD-1、CTLA-4、TIGIT、LAG-3和TIM-3表达正相关，表明其参与肿瘤微环境中的免疫耗竭过程。TICAM2编码TLR的适配蛋白，特别是TLR4。TICAM-2/TICAM-1复合物（MyD88非依赖通路）对于TLR4信号激活是必要的，导致NF-κB和干扰素调控因子（IRFs）信号激活，从而调控先天和适应性免疫反应及炎症。特别是，TLR信号失调与加剧的促炎细胞因子产生相关，涉及肿瘤进展，如在几种肿瘤过程中描述。总体，这些数据支持上述基因在PTC中作为促进肿瘤进展至ATC的介质作用。关于ATC中下调基因，其中三个（PRKCD、CYFIP2和BLNK）被描述具有肿瘤抑制活性，它们的下调与表征未分化癌的更侵袭行为一致。MAP3K1在ATC成分中的下调部分意外，因为甲状腺癌数据显示其在促进PTC形成中的作用。然而，至少在乳腺癌模型中，MAP3K1的肿瘤抑制作用也被假设。最后，EPCAM（上皮细胞粘附分子）在增殖、分化和迁移中起作用。有趣的是，ATC具有EpCAM细胞外结构域丢失和核及胞质 compartment中细胞内结构域积累增加。相反，PTC仅在细胞膜上具有EpCAM细胞外结构域。这可能表明EpCAM在甲状腺癌从惰性向侵袭表型进展中的可能参与。这些数据表明存在不同的免疫调控机制在PTC去分化过程中起作用，导致ATC中免疫介质富集。与Giannini等人研究一致，与巨噬细胞评分相关的免疫特征是在ATC相较于PTC样本中最显著上调的通路。癌症免疫治疗在过去十年中已被证明是某些人类癌的有效治疗选择。使用免疫检查点抑制剂，如抗CTLA-4、抗PD-1和抗PD-L1抗体，允许重新激活适应性抗肿瘤免疫反应，并开启甲状腺癌免疫治疗的发展和临床验证。相应地，在ATC中，除了当前治疗选项（包括手术、放疗、化疗和多激酶抑制剂），免疫检查点抑制剂的使用已在显示PD-L1阳性表达的病例中探索。在本系列中，未观察到未分化和乳头状成分间CD274基因表达的统计学显著差异。然而，使用免疫组化，我们注意到多数病例中ATC成分相较于相应PTC成分PD-L1阳性增加，这一发现与TILs存在无显著相关。ATC样本中PD-L1表达也比PDTC更频繁。基于本系列中PDTC样本通常具有下调的免疫相关基因谱，我们还检查了PD-L1状态是否干扰ATC和PDTC间的免疫基因表达谱。有趣的是，PD-L1阴性PDTC和ATC显示相当稳定的基因表达特征，而PD-L1阳性ATC病例相较于PD-L1阳性PDTC具有显著更多基因上调。研究的最终目的是评估ATC相较于PTC成分中miRNA的差异表达及其与免疫相关基因特征的可能相互作用。我们清楚显示miRNA表达谱主要是组织型特异性而非病例特异性。然而，我们的数据强化了MAPK通路失调作为肿瘤从PTC进展至ATC的标志的主要作用。事实上，ATC中上调的一个miRNA子集特异性靶向MAP3K1，我们在PTC样本中发现其下调。此外，MAPK信号通路是ATC样本中显著失调miRNA损害的第二最相关通路。

研究的主要局限性值得考虑。当前仅12例的系列可能限制数据的整体显著性，特别是统计比较。然而，这反映了ATC的低发病率（具有相关PTC成分的病例更罕见），特别是局部/区域性疾病病例，因此可能指示手术，全球范围内代表不到总体ATC病例的25%。类似我们研究，Ragazzi等人在高甲状腺癌诊断量的机构进行的论文在42年期间（1978至2020）仅收集了8例ATC伴有PTC成分。

总之，我们使用NanoString技术探索了具有共存ATC和PTC成分的甲状腺癌系列中的免疫相关基因表达谱。总体，我们的研究揭示了一个基因和通路子集，在PTC至ATC进展过程中一致受损。然而，需要进一步研究探索它们的功能机制并评估它们作为潜在生物标志物的作用。