SETD1A基因突变通过突触功能失调导致精神分裂症风险的机制研究

本研究针对精神分裂症（SCZ）高风险基因SETD1A的罕见提前终止突变，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了五对等基因人诱导多能干细胞（iPSC）系，通过体外分化为兴奋性神经元（Ngn2-iNs），结合形态学、电生理和转录组学分析，发现SETD1A单倍剂量不足（haploinsufficiency）导致树突复杂性降低、突触传递增强和可塑性异常，并通过调控突触相关基因表达影响神经元功能，为SETD1A相关神经精神疾病的机制提供了新见解。

　　

精神分裂症（Schizophrenia, SCZ）是一种复杂的神经精神疾病，具有高遗传性，影响全球约1%的人口。尽管全基因组关联研究（GWAS）已识别出超过200个风险位点和约120个风险基因，但遗传因素如何导致SCZ病理生理学的机制仍不清楚，这阻碍了基于机制的有效治疗方法的开发。与效应量较小的常见GWAS风险变异相比，效应量较大且外显率较高的罕见疾病风险变异为了解疾病生物学提供了重要线索。SETD1A（SET Domain Containing 1A）是SCZ最强的风险基因之一，其罕见的提前开放阅读框（ORF）终止变异不仅与SCZ相关，还与智力障碍、自闭症和其他神经发育障碍（NDD）有关。

SETD1A编码组蛋白甲基转移酶复合物的一个组分，专门催化组蛋白H3赖氨酸4（H3K4）的单甲基化、二甲基化和三甲基化。H3K4三甲基化（H3K4me3）和单甲基化（H3K4me1）分别是活性基因转录启动子和增强子的典型表观基因组标记。因此，SETD1A的功能丧失（LoF）可能导致表观遗传景观改变，引起基因表达失调，从而参与SCZ的病理生理。此外，组蛋白甲基化也被认为是主要精神疾病（包括SCZ）常见变异GWAS中最富集的基因通路之一。然而，SETD1A也可能具有非催化功能，如调节Cyclin-K和DNA损伤反应，表明其功能可能超出表观遗传调节的范围。

SETD1A的单倍剂量不足已在动物和人类干细胞模型中进行研究。多个Setd1a缺陷小鼠模型显示，神经元形态、突触传递和基因转录受到影响。例如，靶向小鼠exon 4的Setd1a+/- LoF显示轴突分支和树突棘减少、神经元兴奋性增加、兴奋性突触传递趋势增加，影响短期突触可塑性。而靶向exon 7的Setd1a+/- LoF模型则发现兴奋性突触神经传递缺陷，需要突触后SETD1A调节突触前谷氨酸释放概率。类似地，靶向exon 15的Setd1a+/- LoF小鼠神经元（包括兴奋性和抑制性）也显示突触释放缺陷。总体而言，这些Setd1a单倍剂量不足小鼠模型表明，突触传递可能是Setd1a LoF在神经元中的表型表现之一。此外，基因表达改变明显受到Setd1a LoF的影响，可能由于H3K4me3的改变。

在人类中，携带SETD1A+/- LoF变异的个体并未表现出显著的大脑结构异常或严重的小头畸形，这表明神经祖细胞的增殖和分化受损不太可能是该疾病的主要潜在原因。类似地，果蝇SETD1A同源基因在分裂后神经元中对大脑记忆形成至关重要，表明其在发育后神经元功能中的作用。除了动物模型，SETD1A+/- LoF也在人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的神经模型中进行研究。在一对等基因hiPSC携带SETD1A+/- LoF突变衍生的人诱导神经元（iN）细胞中，发现SETD1A表达水平降低导致树突复杂性增强和爆发活动增加。这些变化主要表现在谷氨酸能神经元中，转录组谱中与谷氨酸能突触功能相关的基因集改变反映了这些功能变化。在人iPSC衍生的皮质球状模型中，SETD1A水平降低导致神经突生长减少、自发活动改变和代谢能力改变。尽管有这些研究，但Setd1a+/- LoF小鼠模型中的突触表型似乎不一致，且先前报告中使用的携带SETD1A+/- LoF突变的人iPSC系数量非常有限。因此，需要更广泛的研究来理解人类神经元模型中的突触和细胞表型。

在所有已识别的疾病相关SETD1A突变中，exon 16剪接受体的两个碱基缺失（c.4582-2delAG）是一个复发性突变，最常见于SCZ患者（四例报道）和其他NDD患者（三例）。剪接变异c.4582-2delAG预测会保留内含子15，导致不同的阅读框。为了理解患者特异性突变在人类背景下的影响，我们使用CRISPR/Cas9工程化了五对等基因iPSC系，携带c.4582-2delAG或模拟该患者特异性突变LoF的移码突变c.4596_4597insG（p. Leu1533fs）。我们通过异位表达Ngn2产生兴奋性人诱导神经元（iNs），并全面表征了患者特异性突变在Ngn2-iNs中的转录、形态和功能影响。总体而言，我们的结果提供了令人信服的证据，支持SETD1A+/- exon 16 LoF突变导致SETD1A mRNA的无义介导衰变（NMD）、改变神经元树突复杂性，并通过转录修饰失调突触功能。

本研究主要采用了以下关键技术方法：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在健康对照iPSC系（CD07、CD15、CD19和C11C）中引入SETD1A突变（c.4582-2delAG和c.4596_4597insG），并通过Sanger测序和Western blot验证突变和蛋白表达；通过Ngn2诱导将iPSC分化为兴奋性神经元（iNs），并在小鼠胶质细胞共培养体系中成熟；使用免疫组化、稀疏转染和共聚焦显微镜分析神经元形态和突触密度；通过全细胞膜片钳技术记录神经元的电生理特性，包括自发和诱发突触传递；采用RNA测序（RNA-seq）和生物信息学分析（如差异表达基因分析、GO富集分析、WGCNA）探究转录组变化；使用qPCR和环己酰亚胺（CHX）处理验证NMD机制。

Generation of a SETD1A+/- LoF iPSC lines mimicking patient with SETD1A haploinsufficiency (c.4582-2delAG and c.4596_4597insG(p. Leu1533fs))

研究人员通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，在五个等基因iPSC系中引入了患者特异性突变c.4582-2delAG和模拟突变c.4596_4597insG（p. Leu1533fs）。这些突变导致SETD1A exon 16提前终止密码子，引起单倍剂量不足。Sanger测序确认了突变，且未发现脱靶效应。Western blot显示突变iPSC中全长SETD1A蛋白水平显著降低。

Mutant SETD1A mRNAs are degraded through nonsense-mediated decay (NMD)

研究发现，突变SETD1A mRNA通过NMD途径降解。qPCR显示突变iPSC中SETD1A mRNA水平降低约50%。环己酰亚胺（CHX）处理抑制翻译后，突变mRNA水平显著恢复，证实NMD机制参与调控。

SETD1A+/- LoF excitatory Ngn2-iNs showed decreased dendrite complexity

将突变iPSC分化为兴奋性Ngn2-iNs后，Western blot确认神经元中SETD1A蛋白水平降低。免疫染色显示突触密度无显著变化，但稀疏转染和形态学分析发现突变神经元树突复杂性降低（Sholl分析），树突长度和分支点数量无变化。

SETD1A+/- LoF alters synaptic transmission and short-term synaptic plasticity in Ngn2-iN cells

电生理记录显示，突变神经元膜电容增加、电阻降低（c.4596_4597insG），兴奋性增加（c.4582-2delAG）。自发微小兴奋性突触后电流（mEPSC）频率增加，振幅分布改变。诱发EPSC振幅无变化，但配对脉冲比率（PPR）增加，表明短期突触可塑性异常。转录组分析发现突触前基因DOC2B表达上调，可能与自发释放增加相关。

Transcriptional profiling characterization of SETD1A+/- LoF Ngn2 iNs

RNA-seq分析发现，突变神经元中SETD1A表达下调，差异表达基因（DEGs）富集于突触功能、胺运输和代谢通路。共有116个上调基因和73个下调基因重叠。GO和SynGO分析显示上调基因与突触前终端功能相关。WGCNA识别出7个与突变相关模块，涉及代谢、神经系统发育和突触功能等通路。

研究结论表明，SETD1A+/- LoF突变通过NMD降低SETD1A表达，导致人类神经元树突复杂性降低、突触传递增强和可塑性异常，这些变化可能与SCZ和NDD的病理相关。讨论部分强调，SETD1A突变广泛影响突触功能和基因表达，但研究局限于兴奋性神经元模型，未来需在多种细胞类型和发育模型中验证。该研究为SETD1A相关疾病的机制提供了深入见解，支持突触失调作为SCZ的核心病理过程。