利用小核RNA增强哺乳动物转录本RNA碱基编辑技术为遗传病治疗提供新策略

本研究针对RNA碱基编辑技术在治疗无义突变遗传病中面临的效率与特异性挑战，开发了基于U snRNA的新型编辑系统。研究人员通过将引导RNA与U7smOPT snRNA骨架融合，实现了腺苷至肌苷(A>I)和尿苷至假尿苷(U>Ψ)的高效编辑。该系统在高效外显子基因、长非编码RNA和pre-mRNA剪接位点编辑中表现优异，显著降低脱靶效应，并在囊性纤维化疾病模型中成功恢复CFTR功能，为遗传病治疗提供了更安全有效的工具。

　　

遗传性疾病中有10-15%是由无义突变引起的，这些突变导致提前终止密码子(PTC)的出现，进而引发mRNA的无义介导衰变(NMD)和蛋白质功能丧失。囊性纤维化、Hurler综合征等疾病均与此机制相关。目前临床治疗策略存在明显局限性：小分子PTC抑制剂缺乏靶点特异性，工程化抑制性tRNA虽能通读终止密码子但可能影响正常翻译过程，而反义寡核苷酸介导的外显子跳跃技术则可能改变蛋白质结构。因此，开发兼具高特异性和低侵入性的治疗手段成为领域内迫切需求。

随着基因编辑领域从CRISPR系统向单组分RNA支架技术发展，研究人员开始利用内源性蛋白机器进行RNA水平编辑。其中，招募腺苷脱氨酶(ADAR)的circRNA系统(cadRNA)虽能实现腺苷到肌苷(A>I)编辑，但存在编辑效率受序列上下文影响、细胞类型依赖性明显等问题。另一方面，H/ACA box snoRNA系统能催化尿苷到假尿苷(U>Ψ)编辑，但由于其核仁定位特性，难以有效编辑位于核质中的mRNA前体。

针对这些挑战，加州大学圣迭戈分校Gene W. Yeo团队在《Nature Chemical Biology》发表了创新性研究成果。研究团队巧妙利用内源性富含尿苷的小核RNA(UsnRNA)的核质定位特性，开发了新型RNA碱基编辑系统，显著提升了编辑效率和特异性。

研究人员主要采用以下关键技术：通过分子工程构建U7smOPT snRNA骨架与引导RNA的融合系统；利用亚细胞分级qPCR和滚环放大荧光原位杂交(RCA FISH)技术分析编辑器的定位特性；采用RNA测序(RNA-seq)和差异基因表达分析(DESeq2)评估脱靶效应；通过局部剪接变异(LSV)分析评估剪接扰动；使用双荧光素酶报告系统定量PTC通读效率；应用BID-seq和靶向扩增子CMC测序技术定量假尿苷化效率；在16HBE14o-囊性纤维化人支气管上皮细胞模型中进行疾病建模验证。

A>I editing with engineered UsnRNAs

研究团队首先比较了U7smOPT snRNA、U1 snRNA和cadRNA三种编辑系统的性能。结果显示U7smOPT snRNA在大多数位点表现优异，特别是在外显子数量高的基因(如SMAD4和FANCC)上编辑效率显著高于cadRNA。进一步分析发现，U7smOPT snRNA与cadRNA编辑效率比值与基因外显子数量呈正相关(Pearson r=0.6282, P=0.0121)，而与基因长度或mRNA核输出速率无关。这表明snRNA系统对需要长时间核内加工的高外显子基因具有独特优势。

Off-target genetic perturbations of A>I snRNAs

脱靶分析显示，U7smOPT snRNA产生的基因扰动比cadRNA少4-8倍。有趣的是，cadRNA条件下有267个基因被共同扰动，远多于U7smOPT snRNA条件的42个基因，表明cadRNA存在引导RNA非依赖性机制。通路分析发现这些基因与疱疹病毒感染和双链断裂修复相关，提示cadRNA可能诱发天然免疫反应或作为同源重组模板。剪接分析中，cadRNA产生了更多局部剪接变异事件，这可能源于其对剪接因子的下调作用。

Nuclear RNA base editing with A>I snRNAs

通过亚细胞定位实验，研究人员发现A>I snRNA相比cadRNA具有更强的核定位能力。qPCR显示其核质比显著更高，RCA FISH证实A>I snRNA平均更接近细胞核约2μm，核内定位比例高出约70%。这一特性使其能够更有效地编辑长非编码RNA(lncRNA)和pre-mRNA的3'剪接位点。实验证明，A>I snRNA在HOTAIR、MALAT1和XIST等lncRNA以及多个内源性ADAR敏感和CRISPR碱基编辑器敏感的3'剪接位点上都表现出更高的编辑效率。

Increased pseudouridylation efficiency with U>Ψ snRNAs

研究团队将H/ACA box snoRNA与U7smOPT snRNA骨架融合，创建了U>Ψ snRNA系统。在双荧光素酶报告中，(c)8和(g)8连接子使荧光素酶比值提高了约70%，假尿苷化效率达到约70%，相比snoRNA条件的50%显著提升。在内源性位点测试中，U>Ψ snRNA在所有三个位点上都优于传统snoRNA，假尿苷化率达到20-40%。值得注意的是，这种增强不需要细胞质DKC1过表达，避免了潜在的癌症风险。

在囊性纤维化疾病模型中，表达CFTR靶向U>Ψ snRNA的16HBE14o-细胞CFTR表达水平提高了约2倍，而等效表达水平的snoRNA处理未见明显NMD拯救效果。这表明U>Ψ snRNA能更有效地恢复疾病相关基因功能。

该研究通过巧妙利用内源性UsnRNA的核定位特性，开发了新型RNA碱基编辑平台，解决了现有技术在效率和特异性方面的局限性。A>I snRNA系统在高外显子基因编辑、lncRNA调控和剪接修饰方面展现出独特优势，而U>Ψ snRNA系统则为实现安全有效的假尿苷化编辑提供了新途径。这些发现不仅推进了内源性蛋白介导的RNA碱基编辑工具箱发展，为遗传疾病治疗提供了更有前景的策略，更重要的是证明了亚细胞定位在RNA编辑中的关键作用，为未来设计更精准的基因治疗工具提供了重要启示。由于Sm核心蛋白在所有哺乳动物细胞中高度保守且普遍表达，这一技术平台有望广泛应用于多种细胞类型和遗传疾病治疗领域。