基于PMA-dPCR技术突破空肠弯曲菌VBNC状态检测瓶颈：在食品安全监测中的创新应用

本研究针对空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）在应激条件下进入可存活但不可培养（VBNC）状态导致传统检测方法失效的问题，开发了不依赖PMA增强剂的PMA-dPCR检测方案。研究人员通过优化引物长度和PCR条件，成功实现了对鸡肉样本中VBNC细胞的高灵敏度检测（低至102 CFU/25g），同时有效抑制死菌信号。该技术为食源性病原体的精准监测提供了新方法，对食品安全风险评估具有重要意义。

　　

空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是全球范围内引起食源性疾病的主要病原体之一，每年导致约5亿临床病例和3.76万死亡病例。这种革兰氏阴性微需氧细菌常见于禽肉、生乳等食品中，其感染可引起腹泻、腹痛，严重时甚至引发吉兰-巴雷综合征。传统培养检测方法面临重大挑战——当空肠弯曲菌遭遇低温、营养匮乏等环境压力时，会进入可存活但不可培养（Viable but Non-Culturable, VBNC）状态。这些细胞保持代谢活性和完整膜结构，却无法在标准培养基上生长，成为食品安全监测中隐形的"定时炸弹"。

为解决这一检测难题，日本岐阜大学应用生物科学系的Md. Jannat Hossain等研究人员在《Microbial Pathogenesis》上发表了一项创新性研究。团队通过比较PMA（碘化丙啶单氮唑）结合定量PCR（qPCR）与数字PCR（dPCR）两种方法，建立了无需PMA增强剂即可高效检测VBNC空肠弯曲菌的新策略。

研究采用空肠弯曲菌NCTC11168标准菌株，通过在4°C有氧条件下培养35天诱导VBNC状态形成，利用Live/Dead细菌活力试剂盒验证细胞活性。针对鸡肉样本中不同状态（可培养、死亡和VBNC）的细菌，研究人员进行了两轮PMA处理（含/不含增强剂），并设计长短两种引物（CampF2-108和CampF2-595）来优化检测特异性。通过qPCR和dPCR对加标鸡肉样本进行核酸定量分析，采用Tukey多重比较进行统计学验证。

3.1. VBNC状态的诱导与验证

通过35天低温诱导，空肠弯曲菌在21天后完全失去可培养性，但仍保持90%以上的细胞膜完整性，成功建立VBNC模型。这种状态下的细菌虽然无法形成菌落，但仍维持代谢活性，证实了VBNC状态对传统培养方法的逃避能力。

3.2. PMA增强剂的抑制作用

研究发现PMA增强剂虽然能提高死菌检测的抑制效果，但会显著抑制VBNC细胞的信号检测（Ct值升高）。而不使用增强剂时，PMA-qPCR能有效区分活菌（包括VBNC）与死菌，为VBNC检测提供了关键优化方向。

3.3. 引物长度对检测效能的影响

短引物（CampF2-108）虽能检测所有状态的细菌，但无法有效抑制死菌信号。长引物（CampF2-595）产生的595bp片段为PMA提供更多结合位点，成功在10²-10⁶ CFU/25g浓度范围内抑制死菌检测，但qPCR对低浓度活菌（<10⁴ CFU/25g）的检测灵敏度不足。

3.4. dPCR技术的突破性优势

采用PMA-dPCR结合长引物，研究人员成功实现了对所有浓度VBNC细胞的高灵敏度检测，同时在10²-10⁴ CFU/25g范围内完全抑制死菌信号。即使在每25克鸡肉仅含100个菌体的极低浓度下，dPCR仍能有效检出VBNC细胞，显著优于qPCR的检测极限。

该研究首次证实PMA-dPCR无需增强剂即可特异性检测VBNC空肠弯曲菌，解决了传统方法无法区分活死菌的技术瓶颈。长引物设计（CampF2-595）通过增加PMA结合位点显著提高检测特异性，而dPCR的绝对定量能力克服了qPCR在低浓度样本检测中的局限性。这项技术不仅为空肠弯曲菌的精准监测提供了新工具，更为其他食源性病原体（如沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7等）的VBNC状态检测提供了技术范式。研究成果对完善食品安全风险评估体系、预防隐形食源性疾病传播具有重要实践意义，为开发下一代病原体检测技术指明了方向。