利用PMA-dPCR技术突破空肠弯曲菌VBNC状态检测瓶颈及其在食品安全中的应用研究

本研究针对空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)在胁迫环境下进入可存活但不可培养(VBNC)状态导致传统检测方法失效的难题，开发了基于PMAxx处理结合长片段引物的数字PCR(dPCR)检测方案。该技术成功实现鸡肉样本中低至102 CFU/25g的VBNC细胞检测，为食源性致病菌风险评估提供新方法。

　　

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是全球范围内引发食源性疾病的主要病原体，人类通常通过食用受污染的鸡肉感染该菌。值得注意的是，这种细菌在低温、营养匮乏等环境胁迫下会进入可存活但不可培养(viable but non-culturable, VBNC)状态。VBNC细胞保持代谢活性和完整膜结构，却无法通过传统培养方法检测，成为食品安全监管中的隐形威胁。更棘手的是，这些处于休眠状态的细菌仍可能表达毒力基因，并在适宜条件下复苏，引发潜在的公共卫生风险。

目前分子检测技术如定量PCR(qPCR)虽能检测细菌DNA，却无法区分死菌与活菌。碘化丙啶单氮唑(propidium monoazide, PMA)处理可通过选择性抑制死菌DNA扩增来解决这一难题，但常规PMA-qPCR结合增强剂处理时会意外抑制VBNC细胞的检测信号，且对低浓度样本(低于10⁴ CFU/25g)的检测灵敏度不足。

为解决这一技术瓶颈，日本岐阜大学的研究团队在《Microbial Pathogenesis》上发表论文，系统比较了PMA-qPCR与PMA数字PCR(digital PCR, dPCR)对空肠弯曲菌VBNC状态的检测效能。研究通过35天低温诱导建立VBNC模型，采用双轮PMA处理（不含增强剂）结合长片段引物(CampF2-595)策略，并首次将dPCR技术应用于VBNC细胞的绝对定量。

关键技术方法包括：1）使用Mueller–Hinton肉汤低温诱导VBNC状态；2）基于膜完整性验证的LIVE/DEAD BacLight染色；3）优化PMAxx处理流程（不含增强剂）；4）设计长片段引物增强PMA结合效率；5）采用QIAcuity dPCR系统进行绝对定量；6）以市售鸡肉为样本基质进行加标实验。

研究结果揭示：

3.1. VBNC状态的诱导与验证

通过35天4°C低温培养，空肠弯曲菌在21天后完全失去可培养性，但膜完整性检测显示超过90%细胞保持存活，成功建立VBNC模型。

3.2. PMA增强剂的抑制效应

研究发现PMA增强剂会显著抑制VBNC细胞的检测信号(Ct值升高)，而不含增强剂的处理组能有效区分活菌（含VBNC）与死菌(p<0.05)。

3.3. PMA-qPCR检测局限性

尽管长片段引物(CampF2-595)能有效抑制死菌信号（10²-10⁶ CFU/25g），但PMA-qPCR对低浓度活菌(＜10⁴ CFU/25g)的检测仍存在盲区。

3.4. dPCR技术突破

采用PMA-dPCR结合长片段引物，成功实现所有浓度梯度（10²-10⁷ CFU/25g）的VBNC细胞检测，并在≤10⁵ CFU/25g浓度下完全抑制死菌信号。值得注意的是，10² CFU/25g的低浓度样本中仍可检测到VBNC细胞，显著优于qPCR的检测极限。

本研究首次证实PMA-dPCR（不含增强剂）技术可高效检测鸡肉中的空肠弯曲菌VBNC细胞，解决了传统方法无法区分死菌、活菌及VBNC状态的技术难题。长片段引物设计显著提升PMA对死菌DNA的抑制效率，而dPCR的绝对定量特性克服了qPCR在低浓度样本检测中的局限性。该技术为食品中VBNC病原体的风险评估提供新工具，对完善食源性致病菌监测体系具有重要意义。未来需进一步探究VBNC细胞的毒力表达机制及其与食源性疾病发生的关联性。