靶向P2X4R的人源化单链抗体scFv通过调控外周与中枢神经元兴奋性缓解雄性小鼠神经病理性疼痛

本刊推荐：为解决神经病理性疼痛对传统镇痛药耐药这一临床难题，研究人员开展了靶向P2X4受体(P2X4R)的人源化单链抗体片段(hP2X4 scFv)的生理作用研究。结果表明，单次腹腔注射该抗体能长效逆转小鼠机械性超敏反应，并通过膜片钳技术证实其可选择性降低损伤模型中外周大直径神经元及中枢Fos+神经元的兴奋性。该研究为开发非阿片类镇痛新药提供了重要理论依据。

　　

神经病理性疼痛是一种令人备受折磨的慢性疼痛状态，全球约7-10%的人口深受其害。这种疼痛对常见的非甾体抗炎药甚至阿片类药物都表现出令人沮丧的耐药性，因此，探索其深层机制并开发全新疗法已成为疼痛研究领域的迫切任务。在众多疼痛信号传导的关键分子中，嘌呤能P2X4受体(P2X4 receptor, P2X4R)格外引人注目。它是一种由ATP（三磷酸腺苷）门控的离子通道，在神经或组织损伤后，其在感觉神经元和胶质细胞中的表达会显著上调，驱动神经元异常兴奋，从而在慢性疼痛的维持中扮演着核心角色。有趣的是，研究表明雄性动物在神经损伤后P2X4R的上调更为显著，暗示了疼痛处理机制中存在性别差异。

在此背景下，一项发表在《Neurobiology of Pain》上的研究为我们带来了新的希望。来自美国新墨西哥大学健康科学中心的研究团队深入探究了一种新型人源化抗P2X4R单链可变区抗体片段(humanized single-chain variable fragment, hP2X4 scFv)在治疗神经病理性疼痛中的生理学机制。他们旨在阐明这种具有高亲和力和良好组织穿透性的小分子抗体，是如何通过调控外周和中枢神经系统的神经元活动来发挥其强大的镇痛效果的。

为了开展这项研究，研究人员综合运用了多种关键技术方法。研究使用了两种成熟的雄性小鼠神经病理性疼痛模型：坐骨神经分支选择性损伤(Spared Nerve Injury, SNI)模型和三叉神经眶下孔炎症性压迫(Foramen Rotundum Inflammatory Compression of the Trigeminal Infraorbital Nerve, FRICT-ION)模型，以模拟外周神经损伤性疼痛。行为学上，采用von Frey纤维丝检测机械性痛觉超敏。在机制探究层面，研究采用了先进的FosTRAP转基因小鼠模型，通过他莫昔芬诱导特异性标记在疼痛刺激下激活的Fos⁺神经元，并利用离体脑片和脊髓切片膜片钳技术记录这些关键神经元（脊髓背角Ⅱ板层和腹外侧中脑导水管周围灰质(ventrolateral periaqueductal gray, vlPAG)）的电生理特性。同时，研究也从模型小鼠中分离培养了背根神经节(Dorsal Root Ganglion, DRG)和三叉神经节(Trigeminal Ganglion, TG)神经元，在体外给予hP2X4 scFv处理后，用膜片钳技术系统评估了不同大小直径神经元的兴奋性变化。

研究结果丰富而具有说服力，具体发现如下：

3.1. Humanized hP2X4 scFv reduced pain-like behavior and excitability of lamina II spinal dorsal horn neurons from SNI FosTRAP mice

行为学结果表明，单次腹腔注射hP2X4 scFv能显著逆转SNI模型小鼠的机械性超敏，效果可持续长达四周。电生理记录发现，从经抗体处理的SNI FosTRAP小鼠脊髓切片中记录到的Ⅱ板层Fos⁺神经元，其表现出多重放电和自发活动的比例显著降低。这表明hP2X4 scFv通过降低脊髓背角痛觉传递关键神经元的兴奋性，从而缓解神经病理性疼痛。

3.2. Humanized P2X4 scFv reduced pain-like behavior and altered excitability of ventrolateral periaqueductal neurons from FRICT-ION FosTRAP mice

同样地，在FRICT-ION三叉神经痛模型中，单次注射hP2X4 scFv也长效逆转了面部的机械超敏。对其另一个疼痛调控关键脑区vlPAG的Fos⁺神经元进行记录时，发现了一个有趣的现象：抗体处理虽未改变多重放电和自发活动，但却显著增加了神经元 rebound firing（反弹放电）的比例。反弹放电与T型钙通道活动密切相关，提示hP2X4 scFv可能通过影响vlPAG神经元的特定离子通道活动来调控三叉神经痛。

3.3. Humanized P2X4 scFv reduced larger-diameter DRG neuron excitability from SNI, but not na?ve, mice

研究进一步探寻了抗体对外周感觉神经元的直接作用。体外培养DRG神经元并给予hP2X4 scFv处理后发现，该抗体能选择性降低来自SNI模型的大直径(>25μm)神经元的动作电位发放频率，而对 na?ve（未损伤）小鼠的DRG神经元或SNI小鼠的小直径(<25μm)神经元则无显著影响。这揭示了其作用的模型特异性和细胞类型特异性。

3.4. Humanized P2X4 scFv reduces larger-diameter TG neuron excitability from FRICT-ION, but not na?ve, mice

与此呼应，在FRICT-ION模型的TG神经元中，hP2X4 scFv同样特异性降低了损伤状态下大直径TG神经元的兴奋性，而对 na?ve 状态下的神经元无影响。这再次证实了hP2X4 scFv通过靶向调控损伤后变得过度兴奋的大直径初级感觉神经元来发挥治疗作用。

归纳研究与讨论部分，本研究得出的核心结论是：人源化P2X4 scFv通过多水平调控神经系统的兴奋性来发挥其强大的镇痛作用。在外周，它直接作用于损伤后的大直径DRG和TG神经元，降低其异常兴奋性；在中枢，它既抑制了脊髓背角神经元的过度活动，也调制了脑干vlPAG神经元的放电模式（如增加反弹放电）。这些效应共同导致了疼痛行为的持久逆转。该研究的重要意义在于，它不仅深入揭示了P2X4R在神经病理性疼痛中的具体作用机制，更重要的是，首次详细阐明了靶向该受体的人源化抗体在体内外不同层次上的生理学作用，有力地证明了hP2X4 scFv作为一种新型、高效、持久的非阿片类镇痛候选药物的巨大潜力，为未来临床转化奠定了坚实的理论基础。