单核苷酸分辨率非帽式RNA全长测序技术(NAP-seq)的开发与应用研究

来自国内的研究人员开发了NAP-seq技术，通过T4 PNK预处理、RNase H去除高丰度RNA、随机条形码接头和热稳定逆转录酶等创新方法，实现了对多种末端修饰的非帽式RNA(napRNAs)的全长单核苷酸分辨率测序，为发现新型调控性非编码RNA和揭示RNA生物合成机制提供了突破性工具。

　　

哺乳动物基因组的大部分区域都会被转录成RNA，其中绝大多数是非帽式RNA(non-capped RNAs, napRNAs)。这些分子不仅作为非编码RNA(non-coding RNAs)调控多种生物学过程，还作为加工产物揭示特定的RNA生物合成途径。然而，由于其长度异质性、多样化的末端修饰和复杂的二级结构，鉴定这些napRNAs面临巨大挑战。

近期开发的napRNA测序技术(NAP-seq)能够在单核苷酸分辨率下识别具有各种末端修饰的napRNAs全长序列。该方案详细介绍了实验设计原理和逐步操作流程，包括：使用T4多核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase)预处理以标准化RNA末端，实现对修饰napRNAs的全面捕获；通过大小选择后利用RNase H去除已知高丰度RNA，从而富集长链低丰度RNA；采用带随机条形码的定制接头，在最小化PCR偏倚和接头连接效率问题的同时，实现单核苷酸分辨率的全长napRNAs鉴定。

使用热稳定逆转录酶(thermally stable reverse transcriptase)和巢式逆转录引物(nested reverse transcriptase primers)确保了在结构化或修饰RNA区域的全长cDNA合成，同时减少了错误引发伪迹。文库平行采用牛津纳米孔(Oxford Nanopore)长读长和Illumina短读长测序平台进行测序，协同发挥第三代和下一代测序技术的优势。

从文库制备到深度测序和计算分析的完整实验流程可在8天内完成。NAP-seq方法使研究人员能够发现具有调控功能的新型非编码RNA类别，并在多种组织和细胞系中深入研究RNA生物合成机制。