来自印度平菇（Pleurotus ostreatus）的耐热几丁质酶的分子特性及其对植物病原菌茄病霉（Alternaria solani）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的杀灭效果

《Physiotherapy》：Molecular characterization of thermostable chitinases from Indian Pleurotus ostreatus and their effectiveness against the plant pathogenic Alternaria solani and Fusarium oxysporum

平菇KUFC112、KUFC113、KUFC114三种菌株的几丁质酶合成及特性研究。通过响应面法优化产酶条件，纯化酶的热稳定性达90℃，pH 4-8，耐受多种金属离子。基因测序显示Chi1基因1188bp编码395氨基酸，其中KUFC114序列存在差异。结构预测表明KUFC112/KUFC113与KUFC114的α螺旋和β折叠数量互换，分子模拟验证了蛋白稳定性。

　　

里图帕尔娜·萨卡尔（Rituparna Sarkar）| 贝乔伊塞卡尔·达塔（Bejoysekhar Datta）

印度西孟加拉邦纳迪亚（Nadia）卡利亚尼（Kalyani）大学植物学系真菌学与植物病理学研究实验室，邮编741235

摘要：

几丁质酶在农业、能源生产、食品加工、制药和人类医疗保健领域具有广泛的应用。了解几丁质酶的特性对于探索其在这些领域的潜在用途至关重要。本研究报道了从三种不同Pleurotus ostreatus菌株（分别命名为KUFC112、KUFC113和KUFC114）中提取并表征几丁质酶的过程。评估了这些几丁质酶对植物病原真菌Alternaria solani和Fusarium oxysporum的抑制效果。通过响应面建模优化了酶的产量和活性。经DEAE-纤维素柱层析纯化的几丁质酶在高温（高达90?C）、pH值4-8的范围内，以及存在金属离子（Ca²⁺、Fe²⁺、Mg²⁺和Mn²⁺）、十二烷基硫酸钠和β-巯基乙醇的条件下仍保持稳定。从这三种菌株中获得的完整Chi1基因（1188 bp）编码了395个氨基酸。KUFC112和KUFC113菌株的CHI1蛋白氨基酸序列相同，而KUFC114菌株在氨基酸位置321（P. ostreatus KUFC112为D，P. ostreatus KUFC114为V）、329（A/T）和351（T/S）处存在差异。计算得出三种CHI1蛋白的分子量分别为42.90 kDa和消光系数为52370 M^-1cm^-1。基于CH1氨基酸序列构建的系统发育树证实了这三种菌株与已报道的P. ostreatus菌株之间的亲缘关系。KUFC112/ KUFC113菌株的CHI1蛋白预测二维结构包含11个α螺旋和12个β折叠片，而KUFC114菌株的二维结构包含12个α螺旋和11个β折叠片。CH1蛋白的三维结构是利用内几丁质酶（Uniport: P29029）的模板结构构建并经过验证的。通过分子模拟评估了蛋白质的稳定性与灵活性。

章节摘录

引言：

继纤维素之后，几丁质是第二丰富的可再生生物聚合物，由线性连接的β-1,4-键合的N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）残基组成，这些残基通过氢键高度交联[1]。它是海洋无脊椎动物、昆虫、真菌和硅藻细胞壁的主要成分之一，其中的乙酰胺基团赋予了细胞壁结构刚性。目前，海鲜产业产生了大量几丁质废弃物，其处理问题日益严重。

真菌培养

从三种Pleurotus ostreatus子实体中建立了组织培养物，分别命名为P. ostreatus KUFC112、P. ostreatus KUFC113和P. ostreatus KUFC114。这些子实体于2022年10月在印度西孟加拉邦北24帕尔加纳斯（North 24 Parganas）的哈利萨哈尔（Halisahar）地区（坐标22°56'59" N, 88°25'10" E）采集。通过核rRNA基因区域（SSU-ITS1-5.8S rRNA-ITS2-LSU rRNA）的测序对这些菌株进行了鉴定，并将其存入GenBank，编号为PP594181。

胞外几丁质酶的产生：

Pleurotus ostreatus菌丝在生长15天内覆盖了以几丁质为唯一碳源的琼脂平板（图1.A.i）。随后用刚果红染色并用10 mL 1 M NaCl溶液脱色后，3天大的菌丝菌落周围出现橙色晕圈，证明产生了胞外几丁质酶（图1.A.ii）。所有三种测试菌株（P. ostreatus KUFC112、P. ostreatus KUFC113和P. ostreatus KUFC114）均表现出胞外几丁质酶的产生。

讨论：

含有几丁质的生物会产生几丁质酶，以促进其形态发育和营养吸收。真菌在侵入其他真菌或昆虫体后会产生几丁质酶，从而能够降解几丁质底物以获取碳和氮，从而增强生态竞争力和工业价值。在本研究中，P. ostreatus菌株KUFC112、KUFC113和KUFC114的菌丝培养物能够在以几丁质为唯一碳源的条件下生长，这得益于它们表达的几丁质酶活性。

结论：

P. ostreatus的几丁质酶具有结构韧性、催化效率和抗真菌活性的良好结合。全长基因测序和同源性分析表明，不同菌株之间的蛋白质结构具有高度保守性，氨基酸变异很小。通过修改蛋白质结构或在其活性位点结合活性化合物可以提高酶的效率。实验结果表明，几丁质酶能够在体外环境中抑制病原真菌的生长。

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CRediT作者贡献声明

里图帕尔娜·萨卡尔（Rituparna Sarkar）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、软件使用、方法设计、实验实施、数据分析、概念构思。贝乔伊塞卡尔·达塔（Bejoysekhar Datta）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、项目监督、概念构思

伦理批准：

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利益冲突

所有作者声明不存在利益冲突。

利益冲突声明：

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资助情况

本研究未获得公共部门、商业机构或非营利组织的任何特定资助。第一作者的奖学金由印度大学教育委员会（UGC）提供。

资金来源：

本研究未获得公共部门、商业机构或非营利组织的任何特定资助。第一作者的奖学金由印度大学教育委员会（UGC）提供。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了卡利亚尼大学（University of Kalyani）和印度政府教育委员会（UGC）的资助。