抗菌肽融合内溶素CecA1–8-PlyPw：一种防控大白菜软腐病的新型生物防治策略

本研究针对革兰氏阴性植物病原菌Pectobacterium spp.引起的软腐病，开发了抗菌肽融合内溶素CecA1–8-PlyPw作为新型生物防治剂。该工程化内溶素对多种病原菌表现出广谱杀菌活性，在采收大白菜和幼苗模型中显著减轻软腐症状，并在土壤中有效降低病原菌数量，同时具备良好的安全性特征，为替代抗生素类农化品提供了可持续解决方案。

　　

在全球食品安全面临严峻挑战的背景下，由革兰氏阴性植物病原菌Pectobacterium spp.引起的软腐病每年造成巨大的农作物损失。这些病原菌能够分泌植物细胞壁降解酶，导致植物组织浸渍、萎蔫甚至死亡，对白菜、番茄、胡萝卜、洋葱和马铃薯等多种农产品造成严重危害。更令人担忧的是，传统抗生素类农化品的广泛使用不仅导致抗菌素耐药性（AMR）问题日益严重，还可能通过基因转移影响人类和动物健康。

在这一背景下，研究人员开始探索替代抗生素的新型生物防治策略。噬菌体来源的内溶素（endolysin）作为一种细菌裂解酶，能够直接降解细菌肽聚糖（PG）层，因其物理裂解机制而具有低耐药性风险。然而，革兰氏阴性菌的外膜（OM）成为外源应用内溶素的主要屏障，限制了其应用效果。

为此，研究团队通过生物信息学分析从Pectobacterium wasabiae中鉴定出一种推定内溶素PlyPw，并创新性地将其与抗菌肽（AMP）Cecropin A的八肽片段（CecA^1–8）融合，开发出新型工程化内溶素CecA^1–8-PlyPw。这项研究发表在《Postharvest Biology and Technology》上，为防控软腐病提供了有前景的解决方案。

研究人员采用多种关键技术方法开展本研究：通过生物信息学分析鉴定候选内溶素；利用蛋白质工程构建多种AMP融合内溶素变体；采用亲和色谱纯化重组蛋白；通过活菌计数法和浊度降低测定法评估抗菌活性；利用大白菜采后产品和幼苗模型评估病害控制效果；建立土壤污染模型评估环境应用潜力；并通过植物毒性试验和溶血试验初步评估安全性。

3.1. 推定内溶素PlyPw的鉴定与特性分析

研究人员通过生物信息学分析发现PlyPw具有C端两亲性α螺旋结构，类似于抗菌肽的特征，提示其可能具有穿透革兰氏阴性菌外膜的潜力。然而实验结果显示，原始PlyPw对P. carotovorum Pcc21无效，但对A. baumannii ATCC 17978表现出剂量依赖性的抗菌活性，表明其活性具有菌种特异性。

3.2. AMP融合增强抗菌活性

研究团队测试了三种不同AMP与PlyPw的融合变体，发现CecA^1–8融合变体（H-PC）对P. carotovorum Pcc21实现了超过5-log的细菌减少，效果与商业农化品Agrimycin-100相当。值得注意的是，单独使用的CecA^1–8肽（0.8μM）没有显著杀菌活性，表明融合策略的必要性。

3.3. 结构排列优化杀菌活性

研究人员比较了四种不同结构的CecA^1–8-PlyPw变体，发现CP-H（CecA^1–8-PlyPw-His₆）和H-PC（His₆-PlyPw-CecA^1–8）表现出最强的抗菌活性。其中CP-H在0.4μM浓度下就能将细菌降至检测限以下，且在5分钟内即可实现>2-log的减少，显示出快速杀菌特性。

3.4. 影响抗菌活性的因素

研究发现细菌生长状态显著影响CecA^1–8-PlyPws的活性，静止期细菌相比指数生长期细菌表现出更强的抗性。NaCl浓度也影响活性，随着盐浓度增加，抗菌效果下降，但这种效应因菌种而异。值得注意的是，CecA^1–8-PlyPws在4-80°C温度和pH 4-10范围内保持稳定，显示出良好的环境适应性。

3.5. 广谱抗菌活性

CecA^1–8-PlyPws对多种革兰氏阴性和阳性病原菌均表现出抗菌活性，包括多种Pectobacterium菌种、Xanthomonas spp.、Pseudomonas spp.、A. baumannii、Salmonella spp.、Klebsiella pneumoniae、E. coli以及Staphylococcus aureus、Bacillus cereus等革兰氏阳性菌。

3.6. 大白菜软腐病防治效果

在采后大白菜模型中，CecA^1–8-PlyPws处理（预防性和治疗性）显著减轻了软腐症状，减少了病原菌数量，效果与Agrimycin-100相当。在幼苗模型中，CP-H处理组72%的叶片保持无症状，与农化品处理组效果相似。

3.7. 土壤中病原菌减少

在未灭菌和灭菌土壤模型中，CecA^1–8-PlyPws处理均能显著降低P. carotovorum数量，CP-H的效果与Agrimycin-100相当，表明其在农业环境中控制病原菌传播的潜力。

3.8. 初步安全性评估

安全性评估显示，即使在10倍标准浓度下，CecA^1–8-PlyPws对韩国白菜幼苗不产生植物毒性，且对绵羊红细胞无溶血活性，表明其具有良好的安全性特征。

研究结论表明，CecA^1–8-PlyPw作为一种新型工程化内溶素，能有效控制由Pectobacterium spp.引起的软腐病，在采后处理和农业生产中均表现出良好的应用潜力。其广谱抗菌活性、环境稳定性和良好安全性特征，使其成为替代传统抗生素类农化品的有力候选。这项研究不仅为解决软腐病提供了具体方案，更为应对抗菌素耐药性危机和促进农业可持续发展提供了新思路，符合"一体化健康"（One Health）理念，具有重要的科学价值和实际应用意义。