重组犬玻连蛋白优化犬诱导多能干细胞培养：推动物种特异性无外源成分培养体系建立

本研究针对犬诱导多能干细胞（ciPSCs）培养中存在的异种成分免疫原性风险及细胞外基质（ECM）依赖性难题，通过原核表达系统成功制备重组犬源全长与N端截短型玻连蛋白（cVTN/cVTN-N）。研究证实这两种蛋白可显著支持ciPSCs的黏附、增殖与多能性维持，其效能与人类来源ECM（iMatrix-511/hVTN/hVTN-N）相当，且cVTN-N能显著降低中胚层标志物表达。该成果为建立物种匹配的无外源成分培养体系提供了关键材料，对兽医学再生医学与转化研究具有重要推动意义。

　　

在兽医学和再生医学领域，犬诱导多能干细胞（ciPSCs）因其在疾病建模、药物筛选和个性化治疗方面的潜力而备受关注。然而，传统的ciPSCs培养依赖小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）或异种来源的细胞外基质（如人源玻连蛋白），这些成分可能引入免疫原性风险并影响细胞功能。更棘手的是，监管机构如FDA和EMA强烈建议在细胞治疗产品中消除动物源性成分，因此开发物种匹配、无外源成分的培养体系成为当务之急。

近日发表于《Regenerative Therapy》的一项研究为解决这一问题提供了新方案。大阪都市大学的研究团队通过原核表达系统成功制备了重组犬源玻连蛋白（cVTN）及其N端截短变体（cVTN-N），并系统评估了它们对ciPSCs行为的影响。研究表明，这两种犬源基质在支持细胞黏附、增殖、多能性维持和分化能力方面与人类来源基质性能相当，且cVTN-N还能特异性抑制中胚层标志物表达，显示出调控分化的潜力。这一成果不仅为ciPSCs提供了更安全的培养选择，也为兽医再生医学的临床转化奠定了坚实基础。

研究团队采用了几项关键技术：首先从比格犬肝脏组织中提取RNA，通过分子克隆构建cVTN和cVTN-N的原核表达载体；利用大肠杆菌BL21(DE3)表达系统生产重组蛋白，并通过肝素亲和色谱纯化和尿素变性-复性策略获得可溶性蛋白；通过细胞黏附实验、长期增殖追踪、免疫细胞化学和定量PCR（qRT-PCR）评估细胞行为；最后通过拟胚体（EBs）形成实验和三胚层分化标志物检测评估多向分化潜能。

3.1. Identification of canine-derived VTN gene and its expression and purification

研究首次克隆了犬VTN基因，其编码序列与人类VTN具有76%的氨基酸同源性，且整合素结合RGD motif（Arg-Gly-Asp）在物种间完全保守。通过大肠杆菌表达系统成功获得分子量约60 kDa的重组蛋白，Western blot验证其免疫反应性，最终产量达9.9 mg/200 mL培养体系。

3.2. Adhesion and proliferation of ciPSCs

细胞黏附实验显示，cVTN和cVTN-N在2 μg/cm²涂层浓度下与iMatrix-511黏附效率无显著差异。长期培养（360小时）表明，ciPSCs在所有测试基质上均能保持典型多能性集落形态和稳定增殖速率，证明犬源基质具有与人类基质相当的生物学兼容性。

3.3. Pluripotency maintenance on canine-derived VTN substrates

免疫染色证实cVTN和cVTN-N能有效维持OCT4、NANOG和SOX2蛋白表达。qRT-PCR显示cVTN显著上调SOX2转录水平，而cVTN-N则显著降低中胚层标志物KDR和CD90的表达，提示N端截短可能具有调控谱系分化的潜在功能。

3.4. Multilineage differentiation potential

拟胚体形成实验表明，所有基质组均能支持三胚层分化，免疫染色检测到外胚层标志物TUBB3、中胚层标志物α-SMA和内胚层标志物FOXA2的阳性表达。基因表达分析显示，除人源全长VTN组部分标志物表达较高外，cVTN/cVTN-N与iMatrix-511组无显著差异，证实犬源基质支持多向分化能力。

研究在讨论中深入分析了物种间VTN的功能保守性与差异性：尽管RGD motif完全保守，但犬与人VTN序列差异可能影响蛋白折叠效率（犬源蛋白依赖精氨酸辅助复性）。值得注意的是，cVTN-N表现出与人类 truncated variant类似的黏附增强特性，且能特异性抑制中胚层相关基因表达，这为定向分化调控提供了新思路。

该研究的核心结论是：重组犬源VTN可作为一种高效、物种匹配的基质材料，支持ciPSCs的长期自我更新和多向分化，其性能与人类商业化基质相当。这不仅解决了异源成分带来的免疫原性和监管合规问题，更为建立标准化、临床级犬干细胞培养体系提供了关键技术支撑。未来通过优化表达系统（如采用密码子优化菌株）和提高蛋白纯度，将进一步推动其在兽医再生医学领域的应用转化。