JNK激酶调控HCoV-229E核衣壳蛋白磷酸化：揭示广谱抗冠状病毒药物新靶点

为解决冠状病毒利用宿主信号通路机制不明的问题，研究人员开展JNK激酶调控HCoV-229E核衣壳蛋白磷酸化研究，发现JNK特异性激活介导N蛋白S364/367位点磷酸化，其抑制剂可显著抑制HCoV-229E和SARS-CoV-2复制，为开发靶向宿主激酶的广谱抗冠状病毒药物提供新策略。

　　

冠状病毒的持续涌现和再涌现对全球公共卫生构成重大威胁，从造成普通感冒的229E、HKU1、NL63和OC43等常见人类冠状病毒，到引发严重疾病的SARS-CoV、MERS-CoV以及导致COVID-19大流行的SARS-CoV-2，这些病毒迫切需要开发广谱抗病毒策略。尽管已知冠状病毒高度依赖宿主细胞机制完成其复制周期，但宿主信号通路如何被病毒利用的具体机制仍不清楚。特别是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中的c-Jun N末端激酶（JNK）通路，虽然在多种病毒感染中被激活，但其在冠状病毒复制中的具体功能和机制尚未明确。

为了解决这一科学问题，德国鲁尔大学等机构的研究团队在《npj Viruses》发表了题为“JNK kinase regulates phosphorylation of HCoV-229E nucleocapsid protein”的研究论文。该研究通过多学科方法揭示了JNK激酶在冠状病毒复制中的关键作用，并证明了靶向JNK通路作为广谱抗冠状病毒治疗策略的潜力。

研究团队运用了多种先进技术方法：建立稳定表达JNK激酶易位报告系统（KTR）的Huh7细胞系，通过活细胞显微成像技术动态监测JNK激活；采用定量免疫荧光和Western blot分析验证病毒感染后的JNK磷酸化状态；使用四种特异性JNK抑制剂（JNK-IN-8、AS601245、Bentamapimod和SP600125）进行药理学抑制实验；通过时间进程实验确定JNK在病毒复制周期中的作用阶段；利用特异性磷酸化抗体检测核衣壳蛋白（N蛋白）特定丝氨酸位点（S145/149和S364/367）的磷酸化状态；构建AP-1报告基因系统评估转录因子活性；采用siRNA敲低技术验证JNK功能必要性。

HCoV-229E感染促进JNK磷酸化和信号传导

研究人员首先使用基于激酶易位报告系统（KTR）的成像系统探测活细胞中JNK激酶活性。该系统通过JNK介导的磷酸化事件引起报告蛋白的核质穿梭，从而实时监测JNK活性。研究发现，HCoV-229E感染后约16小时，感染细胞中JNK-KTR从核向胞质易位，特别是在发生合胞体形成的细胞中观察到强烈的报告蛋白易位，表明JNK强烈激活。免疫荧光染色证实JNK-KTR易位仅限于HCoV-229E N蛋白阳性细胞。Western blot分析进一步显示，感染后12-16小时，多种JNK亚型的磷酸化水平增加，同时c-Jun表达和磷酸化增加。这些结果表明HCoV-229E感染在24小时内逐步激活JNK-c-JUN通路，且这种激活仅限于感染细胞而非未感染的旁观者细胞。

JNK抑制阻止HCoV-229E感染

鉴于JNK在HCoV-229E感染中的强烈激活，研究人员评估了抑制JNK激酶活性对病毒感染性的影响。使用四种不同的JNK抑制剂进行的剂量反应实验显示，dsRNA阳性细胞数量呈剂量依赖性显著减少。抑制剂滴定显示IC₅₀值变化微小，表明不同JNK抑制剂效力无显著差异。虽然高浓度抑制剂会降低细胞活力，但在降低病毒复制至少50%的浓度下，细胞活力受损不超过20%。所有四种抑制剂均将感染性病毒产量（TCID₅₀/mL）降低了几个数量级。siRNA介导的JNK1/2敲低也降低了感染性病毒产量。这些数据共同强调了JNK活性在HCoV-229E感染中的必要性。

HCoV-229E N蛋白以JNK依赖性方式磷酸化

为确定JNK影响HCoV-229E复制周期的哪些步骤，研究人员进行了时间进程添加分析实验。在1小时感染期间（预）应用JNK-IN-8或Bentamapimod对产生的感染病毒量没有显著影响，表明JNK抑制不影响病毒附着或进入靶细胞。相比之下，病毒进入后应用任一种抑制剂强烈抑制病毒感染，暗示JNK在病毒复制周期的进入后步骤发挥作用。JNK抑制对每个细胞产生的dsRNA量仅有微弱影响，且在剩余感染细胞中不改变病毒核衣壳蛋白量，表明JNK激活不直接调节病毒复制和蛋白质合成。研究人员假设JNK激活下游宿主因子，参与病毒生命周期的其他步骤。

使用特异性抗体探测SR区域内的磷酸化丝氨酸145和149（S145/149）以及C末端区域内的磷酸化丝氨酸364和367（S364/367）发现，HCoV-229E感染后两个磷酸化位点均出现强烈磷酸化信号。JNK抑制剂SP600125处理降低了N蛋白表达，而剩余N蛋白在S145/149位点的磷酸化比率没有显著降低，表明该位点可由多种激酶磷酸化，不特异性依赖JNK活性。相反，S364/367位点的磷酸化比率在SP600125处理后强烈降低，为病毒诱导的JNK特异性激活有助于调节这些位点的N蛋白磷酸化提供了证据。这些数据表明JNK对病毒N蛋白的磷酸化支持病毒复制周期。

JNK抑制降低SARS-CoV-2感染性

比较所有不同人类冠状病毒N蛋白的基因组序列发现，SR富集域（S145/149）内的丝氨酸残基在所有病毒中高度保守，而N蛋白C末端附近的丝氨酸残基（S364/367）仅存在于HCoV-229E N蛋白中。鉴于SR富集域内丝氨酸残基的保守性以及先前证据强调SR富集域磷酸化对冠状病毒复制周期的重要性，研究人员研究了JNK活性在SARS-CoV-2感染中是否也是必需的。感染表达ACE2和TMPRSS2的人A549肺上皮细胞显示，dsRNA阳性细胞中存在c-Jun磷酸化，暗示SARS-CoV-2感染细胞内特异性JNK激活。JNK-IN-8处理后，c-Jun磷酸化以及dsRNA阳性细胞比例强烈减少，表明SARS-CoV-2感染期间JNK激酶活性的激活和需求。与此一致，所有JNK抑制剂（JNK-IN-8、Bentamapimod和AS601245）均降低了感染性病毒产量（TCID₅₀/mL），且不损害细胞活力。与HCoV-229E结果相似，SARS-CoV-2需要JNK信号传导以实现有效复制。

该研究揭示了JNK激酶在冠状病毒复制中的关键作用，特别是通过介导核衣壳蛋白特定位点的磷酸化来促进病毒复制。研究发现不仅适用于HCoV-229E，也扩展到SARS-CoV-2，表明针对JNK通路的治疗策略可能具有广谱抗冠状病毒活性。由于JNK介导的N蛋白磷酸化位点在冠状病毒中高度保守，开发特异性JNK抑制剂或针对JNK-底物相互作用的干预措施可能为临床提供新型抗病毒治疗方法。

研究强调了研究宿主-病毒相互作用的重要性，以确定潜在靶点和机制，从而开发宿主导向的抗病毒疗法。需要进一步研究来阐明N蛋白磷酸化在不同冠状病毒复制周期中的具体功能，这将有助于完善针对激酶通路的治疗策略，从而为冠状病毒感染以及其他新发和再发病毒提供更有效的治疗方法。

该研究的创新之处在于首次详细阐明了JNK激酶通过调控冠状病毒核衣壳蛋白磷酸化来影响病毒复制的分子机制，并证明了靶向这一通路在不同冠状病毒中的广谱抗病毒效果，为开发新型抗病毒药物提供了重要理论基础和实验依据。