围产期内分泌干扰物诱导神经发育毒性机制研究：基于大鼠海马代谢组图谱的新见解

本研究针对内分泌干扰物（EDCs）诱导发育神经毒性（DNT）机制不明的问题，通过母鼠围产期暴露六种EDCs（BPF、PMT、BBzP、TPHP、PFOS、DINCH），利用靶向和非靶向代谢组学分析PND6子代海马。结果揭示了性别特异性和化学特异性的激素、神经递质及脂质代谢紊乱，发现了非EATS（雌激素、雄激素、甲状腺、类固醇生成）通路的新机制，为EDCs的DNT风险评估提供了新型生物标志物和机制见解。

　　

在当今工业化世界中，人类和野生动物持续暴露于各种环境化学物质，包括阻燃剂、增塑剂、表面活性剂、防水防油涂层、化工助剂以及农药/杀菌剂等。这些物质因其毒性、持久性和生物累积性而引发日益严重的健康担忧。其中，全氟和多氟烷基物质（PFAS）和邻苯二甲酸盐等化学物质已被 linked to 内分泌干扰、致癌性和神经毒性等不良健康效应。它们在消费品和工业应用中的广泛使用导致了全球生态系统污染和人类暴露，促使监管行动和对更安全替代品的需求。

目前，在监管化学测试框架中，关于内分泌干扰（ED）诱导的发育神经毒性（DNT）的信息有限。为了弥补这些空白，研究工作集中在开发替代模型，包括体外、体内和计算机模拟方法，以增进对ED诱导DNT的理解。组学技术在监管毒理学和化学风险评估中获得了显著关注。组学方法能够同时测量多种生物通路，支持作用模式的识别、生物标志物的发现以及不良结局通路（AOPs）中分子起始事件和关键事件的分析。

在此背景下，本研究应用代谢组学研究了出生后第6天（PND6）大鼠海马在暴露于六种已知或潜在EDCs后的分子变化。这些研究的化学物质来自Horizon 2020 ENDpoiNTs项目优先考虑的27种参考EDCs，这些物质是根据其与SELMA和LINC队列中神经发育结局的流行病学关联而确定的。从该列表中，选择了六种代表性化合物，以涵盖主要关注化学类别（邻苯二甲酸盐、双酚、PFAS、拟除虫菊酯农药、有机磷酸酯阻燃剂和替代增塑剂），同时保持可行性并减少动物使用。海马体对记忆、空间导航、情绪调节和神经发生至关重要，因其在大脑发育中的核心作用而被选中。该区域经历延长的出生后神经发生、广泛的突触发生，并且密集分布着类固醇和甲状腺激素的受体，使其对内分泌介导的干扰特别敏感。在大鼠中，出生后第6天（PND6）处于一个关键的发育窗口，其特征是大脑生长高峰、神经回路 refinement 和大脑性分化的持续进行——使得这一时期对环境侵害特别脆弱。在人类中，类似的过程从妊娠晚期持续到婴儿早期。

本研究旨在表征围产期暴露于六种化学物质——双酚F（BPF）、氯菊酯（PMT）、邻苯二甲酸丁苄酯（BBzP）、磷酸三苯酯（TPHP）、全氟辛烷磺酸（PFOS）和环己烷-1,2-二羧酸二异壬酯（DINCH）——对大鼠海马代谢通路的干扰。母鼠从交配前到哺乳期通过饮食单独暴露于一种化学物质。子代在子宫内和通过哺乳期间接暴露直至PND6。这里，我们仅报告高剂量组的结果，因为这些剂量被选择用于最大化早期分子效应的检测。剂量选择由Horizon 2020 ENDpoiNTs项目内进行的广泛文献综述指导，使用了关于发育神经毒性（DNT）、生殖和发育毒性（DART）以及啮齿动物行为研究的可用数据。在研究设计时，几种化合物缺乏合适的围产期神经毒性数据，因此剂量源自相关化合物或早期工作。

研究人员利用靶向和非靶向质谱技术分析了118个PND6大鼠的海马组织。靶向方法侧重于关键的神经发育调节因子，包括类固醇和甲状腺激素、神经类固醇和神经递质。非靶向方法侧重于脂质——EDCs的新兴靶点，对膜形成、突触可塑性和大脑成熟中的信号转导至关重要。通过研究暴露对关键神经发育通路的影响，他们确定了性别特异性、化学特异性和共享的代谢生物标志物，为ED介导的海马发育干扰提供了新的见解，并确定了可能支持未来机制研究和化学风险评估的潜在分子生物标志物。

研究的关键技术方法主要包括：1） 动物暴露模型：使用Long-Evans大鼠，母鼠从交配前至哺乳期通过饮食暴露于单一EDCs或对照物，子代间接暴露至PND6；2） 样本处理：PND6子代海马组织 dissection，使用Allprotect Tissue Reagent稳定并存于-80°C；3） 代谢组学分析：采用靶向LC-MS/MS分析类固醇、甲状腺激素、神经类固醇和神经递质；采用非靶向LC-HRMS脂质组学分析，使用MS-DIAL软件进行数据处理和脂质 annotation；4） 数据分析：包括主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和差异丰度分析（DAA），以识别暴露组与对照组之间的差异代谢物和脂质。

3.1. Metabolic pattern exploration

通过代谢组学分析，研究人员在PND6海马中定量了10种类固醇激素（包括两种硫酸化神经类固醇）和两种甲状腺激素、四种神经递质以及六种神经递质前体。非靶向分析注释了951个脂质特征，并将其分类为6个脂质类别和39个类别。主成分分析（PCA）显示，在雄性中，对照组和暴露组存在明显的聚类，反映了良好的样本可重复性。在雌性中，尽管生物变异性较高，但仍观察到清晰的组别分离。值得注意的是，TPHP和BBzP组与对照组明显分离，表明效应更强，而DINCH和对照组之间存在重叠。

3.2. Identification of key metabolites

3.2.1. PLS-DA

通过单次暴露的PLS-DA分析，确定了区分暴露组与对照组的关键代谢物。变量投影重要性（VIP）得分（>1）用于确定驱动组别分离的最重要代谢物。在雄性中，孕烯醇酮硫酸盐（PREG-S）和皮质酮是所有暴露（除DINCH外）的判别因素。在雌性中，PREG-S在所有暴露（除TPHP外）中被识别，而皮质酮是BBzP、BPF和PMT的VIP。其他激素相关的VIPs是暴露特异性的。神经递质相关的VIPs显示出不同的暴露关联。

3.2.2. Differential Abundance Analysis

在所有暴露-对照组比较中，共鉴定出13个靶向差异丰度代谢物（DAMs）。在性类固醇中，暴露于BPF、DINCH、PMT和TPHP后，雄性中的睾酮水平下调。神经类固醇也受到影响，PREG-S和硫酸脱氢表雄酮（DHEA-S）显示出暴露依赖性改变。皮质酮在暴露于TPHP、BPF、PMT和BBzP的雄性中持续下调。甲状腺激素显示出化学特异性效应，T3水平在雌性中被PMT下调，在雄性中被PFOS下调，而T4水平在暴露于PFOS和PMT的雌性中下调。神经递质表现出暴露和性别特异性反应。

脂质组学分析进一步证实了代谢改变，在雄性和雌性的各种比较中，几个脂质特征被归类为高VIP（> 1）。所有化学物质都影响了PND6大鼠海马的脂质组，除了雄性中的BPF，没有DALs符合 cutoff 标准。暴露影响在雄性脂质组上比雌性更显著。在脂质类别水平上，雄性中39个脂质类别中的37个受到至少一种化学物质的影响，雌性中39个脂质类别中的31个受到至少一种化学物质的影响。评估脂质类别变化的总体方向具有挑战性，因为同一类别内同时存在上调和下调的DALs。通过计算每个类别中所有脂质的丰度之和，确定了差异丰度脂质类别（DALCs），结果显示 distinct 性别和化学特异性脂质类别失调。

4. Discussion

4.1. Metabolic regulation of neurodevelopment: implications for EDC exposure

EDCs日益与儿童不良神经发育结局相关，如自闭症谱系障碍（ASD）、注意缺陷多动障碍（ADHD）和其他智力残疾。越来越多的证据表明，胎儿和围产期代谢修饰可以永久影响神经发育过程。尽管代谢在大脑发育中起着至关重要的作用，但大多数将EDC暴露与DNT结局联系起来的研究忽略了代谢改变作为关键终点。传统上，研究集中在EATS（雌激素、雄激素、甲状腺和类固醇生成）通路上，特别是在PFAS、邻苯二甲酸盐和双酚的背景下。然而，糖皮质激素、神经类固醇、神经递质以及脂质代谢和信号传导仍然较少被表征，尽管它们与EATS通路紧密相连。

4.2. Chemical-and sex-specific perturbations of hormonal signaling pathways in the neonatal hippocampus

4.2.1. Sex Steroids

睾酮在暴露于BBzP、DINCH、TPHP和PMT的雄性PND6海马中持续下调，表明早期生命雄激素信号传导受到干扰。这与大量文献一致，表明邻苯二甲酸盐和其他EDCs以剂量、性别和化合物特异性方式干扰下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴和睾酮合成。相比之下，BPF在雄性中没有显著影响睾酮，这与相对于BPA较弱的抗雄激素特性一致。雌激素要么未检测到（雌二醇），要么在暴露后任一性别中没有显著改变（雌酮）。这可能反映了低局部雌激素生物合成和此早期阶段的技术检测限。

4.2.2. Thyroid Hormones

研究结果揭示了围产期EDC暴露后甲状腺激素T3和T4的性别和化学特异性破坏。T3水平在雌性中被PMT下调，在雄性中被PFOS下调，而T4水平在暴露于PFOS和PMT的雌性中降低。这些模式突出了甲状腺信号传导对化学干扰的性别二态性敏感性，这可能反映了发育早期两性之间脱碘酶活性、甲状腺受体表达或系统性激素调节的差异。

4.2.3. Glucocorticoids

在大多数化学物质中，皮质酮的持续下调——尤其是在雄性中——表明糖皮质激素信号传导是围产期EDC暴露的一个共享且敏感的靶点。值得注意的是，PFOS是唯一与雄性中皮质酮轻微上调相关的化学物质，表明了一种不同的化学特异性调节。

4.2.4. Neurosteroids

研究人员观察到PREG-S和DHEA-S的性别和化学特异性改变，强调了海马中神经类固醇信号传导对早期生命内分泌干扰的敏感性。PREG-S在两性暴露中持续受到影响。这些二态性模式可能反映了神经类固醇生物合成以及硫酸转移酶/硫酸酯酶活性的差异，这些酶在硫酸化和游离神经类固醇之间相互转换。

4.3. Lipid pathways at the endocrine–neurotransmitter interface in early brain development

脂质代谢成为早期生命化学暴露的一个关键靶点，在发育中的海马中多个脂质类别出现显著的性别和化学特异性改变。磷脂水平在PMT暴露后持续下调，尤其是在雄性中，而TPHP暴露导致两性磷脂增加。PFOS诱导了 divergent 磷脂反应，雌性中减少，雄性中增加，表明膜脂质稳态存在性别依赖性调节的潜力。鞘脂，包括神经酰胺和鞘磷脂，也显示出暴露和性别特异性调节，指向对结构和信号脂质库的更广泛影响。

胆固醇调节似乎对化学暴露特别敏感，且具有性别特异性。PMT导致雄性胆固醇水平降低，而BPF和TPHP增加了雄性胆固醇，PFOS增加了雌性胆固醇。这些效应可能反映了多个相交的调节机制。NAEs是最持续受影响的脂质类别之一，但具有 distinct 性别和化合物特异性模式。

4.4. Endocrine–lipid–neurotransmitter crosstalk in EDC-induced DNT

研究结果揭示了发育暴露于测试化学物质后，神经递质水平主要是性别和化学特异性改变。组胺和乙酰胆碱是最常受影响的神经递质，同时还有色氨酸和GABA的改变。这些结果与将EDCs与神经递质失调联系起来的证据一致。

这些神经递质干扰嵌入于EDC暴露诱导的更广泛的内分泌和脂质改变网络中。硫酸化神经类固醇微调GABA能和胆碱能信号传导，而甲状腺激素调节神经递质循环和受体表达。糖皮质激素除了在神经元分化中的发育作用外，还调节GABA能和谷氨酸能活性，并通过GR-PPAR信号传导与能量和脂质代谢相交，从而将内分泌调节与NAE和内源性大麻素通路联系起来。NAEs和AEA反过来直接调节神经递质释放，在内分泌-脂质-神经递质界面增加了另一个调节层。

本研究通过研究对大脑发育至关重要的通路的干扰，显著增进了我们对化学暴露相关的DNT的机制理解。研究人员使用靶向和非靶向质谱检查了六种已知或潜在EDCs对PND6大鼠海马的影响，强调了将DNT评估 beyond 常规激素通路扩展到包括神经类固醇、神经递质和脂质的必要性。在测试剂量下，观察到性别和化学特异性效应，广泛的脂质改变通常在雄性中更为明显。皮质酮、PREG-S和NAEs，以及几种磷脂和鞘脂，被所有六种化学物质持续干扰，无论化学类别如何。这些发现为跨化学物质的作用机制提供了证据，并确定了EDC暴露与已知和新型神经发育终点之间的相关性和潜在因果联系。它们还揭示了跨分子系统的协调改变，强调了内分泌、神经递质和脂质调节之间的通路交叉对话在塑造神经发育结局中的重要性。总之，这些发现支持将非EATS代谢标志物整合到未来的DNT测试框架和监管策略中。

该研究旨在表征发育暴露于六种已知或疑似EDCs的早期分子效应，重点关注PND6大鼠海马的代谢干扰。使用靶向和非靶向质谱，目的不是测试单一的机制假设，而是筛选受干扰的通路和分子特征。这种基于组学的方法突出了受化学暴露影响的候选机制和神经发育相关通路，但并未直接建立因果关系。虽然数据揭示了清晰的性别和化学特异性代谢特征，并识别出持续受干扰的通路，但这些变化在神经发育中的功能作用仍有待实验验证。为了向机制理解迈进，未来研究应采用通路特异性验证方法（例如，受体结合和报告基因检测；体外激动剂/拮抗剂共暴露研究）。在不良结局通路（AOP）框架内，代谢组学可以建议候选分子起始事件（MIEs）并直接识别可测量的关键事件（KEs），从而将早期代谢干扰与不良神经发育结局联系起来，并指导靶向验证。

最后，该研究依赖于基于先前啮齿动物DNT和行为研究的单剂量暴露。由于对EDCs的代谢反应通常是非单调的，较低的环境相关剂量可能会产生不同的模式。此外，人类暴露通常涉及慢性混合物而非单一化合物。因此，未来研究应检查更广泛的浓度范围，并纳入混合物模型，以更好地反映现实世界的暴露情景及其性别特异性影响。