基于高内涵分析的2D与3D HepaRG模型化学物毒性机制谱比较研究：推动新方法策略在毒性评估中的应用

本研究针对化学物毒性评估中动物实验的局限性，开发了基于高内涵分析（HCA）的2D和3D HepaRG模型，用于系统评估化学物的机制毒性。研究发现3D模型在检测细胞毒性、氧化应激、线粒体功能障碍和脂质积累等方面表现出更高敏感性，并揭示了不同细胞改变之间的相关性。该研究为化学安全评估提供了快速、人源相关的体外方法，显著增强了新方法策略（NAMs）的预测能力。

　　

随着人类活动产生的化学物种类日益增多，全球已有超过35万种新型化学物被引入环境，这些化学物对人类健康和环境构成潜在威胁。传统的化学物毒性评估主要依赖动物实验，但这些方法存在耗时、昂贵、伦理争议以及种属差异导致的人类相关性有限等问题。这促使科学界迫切需要开发新方法策略（New Approach Methodologies, NAMs）来评估化学物相关毒性。

肝脏是外源物质（xenobiotics）的主要靶器官，因此肝毒性评估成为化学安全评估（Chemical Safety Assessment, CSA）的重点领域。常见的肝毒性物质会影响细胞水平的多种生物学功能，包括氧化应激、线粒体功能障碍、脂质代谢改变和炎症反应等。深入了解这些细胞机制对于改进化学物毒性预测和评估至关重要。

在此背景下，研究人员开展了一项创新性研究，比较了2D和3D HepaRG模型结合高内涵分析（High-Content Analysis, HCA）在化学物机制毒性分析中的应用。该研究作为欧洲化学品风险评估伙伴关系（PARC）项目的一部分，旨在为化学物毒性评估提供高通量、人源相关的体外策略。

研究人员主要运用了几项关键技术方法：使用2D HepaRG单层细胞和3D HepaRG球体模型培养系统；通过高内涵分析技术同时定量多个细胞终点，包括细胞毒性、线粒体功能（使用TMRE探针检测ΔΨm）、氧化应激（使用H₂

3.1. 2D HepaRG细胞的机制性细胞变化

3.1.1. 细胞毒性

研究发现，经过72小时重复处理后，CT、Tebu和3MCA处理显著降低了2D HepaRG细胞计数，而TAA、BPO、DEM、CF和IP处理未观察到细胞计数影响。

3.1.2. 线粒体膜电位（ΔΨm）影响

CT处理引起浓度依赖性的ΔΨm显著降低，而Tebu、IP和3MCA处理则导致ΔΨm显著增加，表明不同化学物对线粒体功能的影响机制存在差异。

3.1.3. 氧化应激

3MCA处理导致活性氧（ROS）水平显著增加，Tebu和TAA在最高测试浓度下也引起ROS水平轻微上升，其他化学物未观察到ROS水平变化。

3.1.4. 中性脂质积累

Tebu处理在25和50μM浓度下引起中性脂质积累显著增加，而其他测试化学物未观察到脂质积累的增加或减少。

3.1.5. NF-κB核转位

只有Tebu和3MCA处理在72小时后诱导了NF-κB核转位的显著增加，表明这些化学物可能引发炎症反应。

3.2. 3D HepaRG球体的机制性细胞变化

3.2.1. 细胞毒性

3D球体模型显示，CT、Tebu和3MCA处理引起浓度依赖性的ATP水平显著降低，TAA、TPA和Azox处理也导致ATP水平下降但未达统计学显著性。

3.2.2. 线粒体膜电位影响

Tebu和3MCA处理导致ΔΨm显著降低，而BPO、CF和IP处理引起TMRE荧光显著增加，DCMU处理也导致ΔΨm显著增加。

3.2.3. 氧化应激

CT、Tebu、TAA、DEM、3MCA和Azox处理均引起3D球体中ROS水平增加，显示3D模型在检测氧化应激方面具有更高敏感性。

3.2.4. 中性脂质积累

几乎所有测试化学物都引起中性脂质含量的改变，CT、Tebu、TAA、DEM、CF、3MCA、DCMU、TPA和Azox处理导致脂质水平显著增加，而BPO、IP和FICZ处理引起脂质含量显著降低。

3.3. 细胞反应谱分析

通过热图和层次聚类分析发现，3D HepaRG球体在细胞毒性谱变化方面显示出更高的振幅，与2D模型相比具有更高的敏感性。

3.4. 多变量剂量反应分析

主成分分析（PCA）显示，与2D HepaRG模型相比，3D模型中测试化学物的浓度依赖性聚类更加明显，中高浓度处理沿主成分显示出更大的分离度。

研究结论表明，3D HepaRG球体模型在检测细胞毒性、氧化应激、线粒体功能障碍和脂质积累等方面表现出比2D模型更高的敏感性。这种增强的敏感性可能源于3D模型更接近体内复杂的组织样结构，具有更高的生理相关性。研究发现线粒体功能障碍与脂质积累之间存在相关性，这支持了线粒体功能紊乱通过抑制线粒体脂肪酸氧化导致脂质滴积累的机制。

该研究的重要意义在于为基于NAMs的化学安全评估提供了强有力的体外方法支持，特别是在化学物危害识别和特征描述方面。通过整合高内涵分析和3D肝球体模型，研究人员建立了一个快速、信息量丰富的筛选平台，能够同时评估多个毒性终点，显著增强了化学物毒性风险的体外识别能力。3D HepaRG球体的使用为化学物分类和优先排序提供了高预测性和敏感性，有望减少对动物试验的依赖，推动毒理学评估向更人性化、更高效的方向发展。

这项研究发表在《Toxicology》期刊上，为未来化学安全评估提供了重要的方法论参考，也为进一步研究化学物特异性反应的分子机制奠定了基础。