基于刃天青的代谢检测法在三维细胞培养中连续监测活力的优化研究：以Presto Blue?为例

为解决三维（3D）细胞培养中连续活力监测的难题，研究人员系统评估了Presto Blue?（PB）法的适用性。通过优化人真皮成纤维细胞（HDFs）在I型胶原支架上的培养条件，发现重复检测会导致细胞脱落，从而造成读数偏差。研究提出了3-5天的采样频率方案，为3D培养中准确、连续评估细胞活力提供了关键方法学依据。

　　

在组织工程和再生医学领域，三维（3D）体外细胞培养技术正迅速发展，但如何准确、连续地评估这些复杂构造中细胞的活力却是一个长期存在的挑战。传统的活/死细胞染色和成像方法虽然常用，但属于破坏性检测，往往需要使用细胞毒性染料、样品固定或切片处理，这不仅阻止了连续培养的可能性，还导致需要牺牲大量样本以观察多个时间点的效果。间接方法如葡萄糖消耗或尿素产量的测量则受培养条件影响较大，且不能实时反映细胞活力。还原性代谢检测法，特别是基于刃天青（resazurin）的检测法如AlamarBlue?（AB）和PrestoBlue?（PB），因其水溶性、 reportedly 无毒性、操作简便和结果快速等特点，成为有吸引力的非侵入性活力监测工具。然而，在3D培养系统中，这些检测法主要被半定量地用于指示活力的相对趋势，获取定量的细胞数量值仍然具有挑战性，尤其是在进行连续测量时与终点评估相比。现有方法存在不一致性，例如取样量、荧光与吸光度测量的不统一、缺乏校准曲线、以及与细胞数量相关性不明确等问题。因此，迫切需要系统研究并优化这些方法，以确保在3D培养中获得准确、可重复的活力评估结果。

本研究由牛津大学生物医学工程研究所的Veronica M. Lucian等人开展，旨在阐明现有PB方法在3D培养中不一致性的来源，并开发一个可靠的协议用于连续活力监测。研究人员以人真皮成纤维细胞（HDFs）为模型细胞系，将其接种在I型胶原薄膜和支架上，作为模型组织构建体。I型胶原因其在组织工程中的相关性和可调特性而被选择，它占人体胶原的约90%，广泛存在于多种组织类型中。胶原支架已被用于心脏组织、皮肤、神经、肌腱和韧带等组织模型，并且可以轻松制备成2D或3D形式，其附着性和力学性能可以通过交联策略轻松操纵，从而允许探索一系列生化和结构变量。

为了开展研究，作者应用了几个关键技术方法：首先，制备了1%（w/v）的I型胶原悬浮液，通过均质化和离心去除气泡，分别通过滴铸和冷冻干燥制备2D薄膜和3D支架。这些基质通过EDC-NHS（1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺）进行交联，以调整其机械性能和整合素结合位点可用性，标准交联条件为30%（即1.5 EDC:0.6 NHS:1胶原）。样品灭菌后，使用来自CellsDivision的成人HDFs（CCD-6006）进行细胞培养，细胞在含10%胎牛血清（FBS）的高葡萄糖DMEM中培养，传代使用0.05%胰蛋白酶-EDTA。细胞密度通过Countess 3自动细胞计数仪和台盼蓝染色确定。对于2D样品，采用顶部接种；对于3D样品，根据细胞数量采用顶部接种或均匀接种技术（ adapted from Malcor et al. (2020)）。PB检测优化为使用10% PB在培养基中（v/v）孵育1小时，然后使用荧光读数（520/10 nm激发，590 nm发射，1825增益）测量100 μL等分试样。细胞数量根据校准曲线计算：细胞数 = RFU / 1078 × 总样品体积（其中RFU是板读数器记录的相对荧光减去空白参考的平均值）。为验证PB结果，还进行了乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测，使用Cytotoxicity Detection Kit（Roche），并在1% Triton-X中裂解细胞以确认细胞数量。研究还考察了细胞传代次数、孵育时间、基质化学修饰和总染料暴露时间作为自变量对PB检测结果的影响。

研究结果部分通过多个图表展示了详细的发现。

在“PB检测验证和3D中观察到的下降”部分，研究人员发现，在2D培养中，HDFs表现出正常的生长曲线，包括预期的延滞期、对数期、稳定期和死亡期，其规模取决于起始细胞浓度或接种密度（图1）。这些预测的生长曲线与细胞传代次数无关。此外，PB检测证实可用于评估培养物中化合物的毒性（图2），PB报告的“活”细胞数与LDH报告的“死”细胞数直接互补，验证了检测所报告的细胞活力数。然而，在3D交联样品中，报告的细胞数量持续下降（图3）。为了确认报告细胞数量的下降不是细胞代谢下降所致，对接种的支架进行故意裂解，并在PB检测后进行LDH细胞毒性检测。在较低的细胞接种数下，PB和LDH检测计算的报告细胞数量没有统计学差异，无论是否使用抗生素（图4）。对于接种了100,000个细胞的支架，LDH检测报告细胞数量显著低于PB检测报告的数量（p < 0.0001），证实PB检测后存在的细胞数量较低，且下降幅度随接种数增加而增加。

在“消除变量”部分，研究发现，在具有1 mL培养基的24孔板中培养的细胞接种支架与在具有0.5 mL培养基的48孔板中培养的样品之间，细胞数量没有显著差异（p > 0.05）。无论细胞是否与P/S（青霉素-链霉素）一起孵育，报告的细胞数量也相似。观察到的趋势在3D中与接种密度、培养物体积和抗生素的存在无关，这表明营养缺乏或与抗生素的负面相互作用不是3D中观察到的下降的主要原因（补充图7,8）。

在“传代次数和重复PB检测”部分，研究显示，随着连续检测次数的增加，接种的支架中细胞数量显著下降，与细胞传代次数无关（图5）。两个自变量之间没有发现显著相关性（p > 0.05），表明下降不是原代细胞在较高传代次数下失去复制潜力的结果。这种下降在缺乏PB的情况下也会发生；在模拟检测过程的假对照组中，仅更换培养基而不添加试剂，也观察到类似的数量（图6）。

在“细胞附着期”部分，比较了不同孵育时间后首次PB检测报告细胞数量（图7）。样本组之间没有发现显著性。还评估了孵育时间对10天检测期间报告细胞数量的影响（图8）。仅在检测前未提供额外孵育时间的样品中，在10天内观察到细胞数量的稳定增加。检测前孵育5天和7天的样品在第5天到第10天之间报告细胞数量显著下降。检测前孵育两周的样品在10天检测期间没有观察到报告细胞数量的显著变化。

在“2D和3D中的基质交联浓度”部分，评估了交联浓度对2D（图9）和3D（图10）报告细胞数量的影响。对于所有交联浓度，随着5次连续检测，观察到细胞数量显著下降。2D和3D样品的归一化曲线（图11）显示，最陡峭的下降出现在3D样品中，较高的交联浓度与较低的细胞数量相关。

在“采样频率”部分，为了评估在不引起显著细胞脱落的情况下连续使用PB的能力，测试了采样率对接种在3D支架上的细胞的影响，这些支架在应用检测前没有休息。每天检测一次的样品报告细胞数量显著下降，但每3天或每5天采样一次则导致细胞稳定增加，产生与仅在最后一天检测的样品相似的细胞数量（图12）。这表明这两种采样率都允许足够的细胞恢复时间。

讨论部分深入分析了这些结果。“基质几何形状的影响”指出，初步结果采用每日采样频率显示，当使用PB测量HDF活力时，2D细胞显示正常生长曲线，但3D培养细胞数量持续下降。这种现象与细胞类型、培养容器和抗生素使用无关。Podgórski等人观察到类似结果，承认成纤维细胞在2D的生长不同于3D结构。细胞在3D经历一个在2D平面培养中不存在的迁移前延滞期，并且在3D胶原凝胶中观察到HDFs的较低增殖率和胶原生产。一种可能的驱动机制可能源于3D细胞表现出的不同牵引力。当与减缓的迁移和潜在的增殖减少结合时，效果可能复合，导致在3D支架中应用检测时观察到的细胞数量下降比2D薄膜更大。虽然Podgórski等人还提出刃天青和试卤灵染料对纳米纤维材料的吸附可能导致较低的荧光值，但本研究通过空白支架在相同检测条件下校正了染料吸收引入的任何伪影。因此，支架材料与染料本身的相互作用不是造成表观细胞数量下降的因素。此外，Bonnier等人（2015）假设观察到的2D模型和3D系统之间的差异是由于3D矩阵中必须发生的试剂扩散，以及基质中稀释导致检测有效浓度降低。比较轻度压缩支架在孵育前后与对照的结果（补充图10）证实，简单扩散不足以分布试剂。当加入压缩时，报告细胞数量与故意裂解细胞进行的LDH检测没有显著差异，表明包含轻度压缩的PB协议准确识别细胞数量。然而，在10天期间仍然观察到3D报告细胞数量下降，表明有其他因素导致3D中观察到的较低细胞计数。

“分离染料诱导的细胞毒性与检测诱导的操作”部分指出，连续应用检测显示，随着3D中重复检测，细胞数量显著下降（5倍，p < 0.05）。这种效应与传代次数无关；早期传代细胞的行为与中期和晚期传代细胞相同，表明报告细胞数量的下降不太可能是由于培养时间增加导致复制潜力丧失的结果。许多研究报道刃天青对哺乳动物细胞无毒，不影响细胞活力或生长，当与2D单层中观察到的正常生长曲线结合时，表明细胞毒性不太可能是主要因果机制。比较重复PB暴露与细胞加假培养基对照的影响的实验进一步支持这一点，其中细胞数量下降 regardless of the presence of PB。这些结果表明，在3D中进行准确PB测量所需的基质操作因此是细胞数量下降的主要原因，其中与移液和压缩相关的剪切应力 required to homogeneously distribute the reagent 导致每次重复检测时细胞从支架上复合脱落。

“结合位点可用性的影响”部分指出，HDFs利用整合素结合附着到胶原基质，特别是通过具有β₁亚单位的整合素。β₁亚家族中的整合素通过I型胶原中发现的GFOGER序列作为胶原受体。EDC-NHS交联胶原的机制已被认为干扰这种整合素结合；交联发生在谷氨酸和精氨酸/赖氨酸之间， thereby disrupting the metal ion dependent adhesion site (MIDAS) motifs supported by the glutamic residue and ablating the GFOGER motifs on collagen。基序的消除可以通过交联剂浓度控制；即，较低的EDC:NHS:胶原比率将导致更少的整合素结合位点受到影响。因此，为确定细胞附着是否是报告细胞数量逐渐下降的一个 contributing factor，我们在不同浓度交联的支架上进行了连续检测，以确认细胞附着所起的作用。再次，随着每次连续检测观察到显著下降，但下降幅度在较高交联浓度下显著更大（图10）。为确定检测管理期间的细胞脱落是否特定于3D构建体，在接种的2D胶原薄膜上重复了交联测试。随着连续检测，仍然报告了统计上显著的细胞数量下降（图9）；然而，下降幅度远小于在相同浓度交联的3D支架中观察到的（图11），这可能归因于3D支架中细胞经历的剪切应力增加。2D中连续检测的结果进一步支持细胞附着，例如通过整合素结合，是导致检测随时间报告细胞数量下降的一个因素。直接接种在孔板上的细胞比那些接种在胶原薄膜上的细胞表现出更陡峭的细胞数量下降，无论交联如何（图11,9）。薄膜包含整合素结合位点，而组织培养塑料没有。接种在较高浓度交联的构建体上的细胞可能更容易脱落，特别是在检测管理过程中支架发生的操作（图10,11）。这表明，报告细胞数量的下降并不直接转化为活力的下降，尤其是在短时间尺度上完成多次检测时。

“采样频率和细胞孵育时间”部分指出，改变支架在PB测试前的孵育时间，以确定允许额外的迁移和细胞外基质沉积时间是否会形成更内聚的基质，以限制PB添加/采样期间的细胞脱落。发现接种30,000个细胞的支架最初报告细胞数量与接种一半数量并孵育5或7天然后检测的支架相当（图7）。观察到约30%的原始细胞数量的回收率。然而， only scaffolds given no rest days generated positive growth curves with a significant increase in cell number through day 10（图8）。检测前休息5天和7天的样品在采样第5天到第10天显示显著下降，而休息两周的样品在采样天数之间没有显示显著差异。有可能检测前的延长孵育时间允许形成屏障坏死核心，导致支架可以支持的细胞数量减少。对接种支架的采样频率测试评估 given no rest resulted in similar numbers, within error (p > 0.05), on day 9 or 10 regardless of if samples were taken every 3 days, 5 days, or only on day 10（图12）。尽管使用了不同的采样频率——因此不同的细胞损失——细胞数量的相似性进一步指出细胞脱落是细胞数量下降的主要 contributing factor。然而，在误差范围内，细胞的整体行为在10天期间恢复，对报告细胞数量没有显著影响（p > 0.05）。在此期间产生的 positive, and reproducible growth curves likely result from the combination of cells reattaching to the substrate and the exponential rate of cell proliferation rendering the proportion of cells lost due to the assay negligible。因此，确定一个无休息天数的协议 with a 3–5 day sampling frequency is optimal to generate growth curves that allow the effects of other variables on the system to be distinguished without introducing a confounding PB sampling artefact。

“研究的局限性和未来工作的建议”部分指出，当前工作的一个关键限制是需要确保足够的试剂扩散以确保准确读数，同时最小化胶原基质的操作以避免伪影。需要在添加PB后快速进行读数，通常在一两个小时内， necessitates the need for a method of forced convection of reagents through the scaffold。虽然这项工作使用PrestoBlue?作为刃天青应用的试剂，但可以购买分离的刃天青盐作为更便宜的替代品（例如Invitrogen的R12204）。这项工作中的协议仍然适用；然而，需要首先完成PB检测的刃天青浓度优化，如补充所示（补充图1-4）。未来的工作可能研究方法以增加剪切应力的情况下改善试剂扩散，如在生物反应器系统中，并探索刃天青和试卤灵影响基因/蛋白质表达和细胞代谢的机制（如果有的话）。

结论部分总结道，基于刃天青的检测法可用于活力测试，但当用于评估连续细胞培养时，应考虑基质维度、基质生物化学和采样频率的额外因素。为确保准确测量而涉及的物理操作会导致细胞脱落，这可能表现为错误低的活力计数。这种效应通过在3D基质和交联以拥有较低整合素结合位点可用性的基质中观察到的复合效应得到确认。虽然交联对于调整组织构建体的机械性能是必要的，但其对细胞脱落的影响表现为检测中的伪影，应与其作为交联剂对整体细胞增殖和活力的影响分开解决。这在 conducting continuous viability assays时尤为重要，因为细胞数量的下降并不直接转化为细胞活力的下降。为了缓解这些问题，我们得出结论，应仔细确定每个基质和细胞系统的采样率，以确保检测产生可靠的结果；对于EDC-NHS交联胶原支架上的HDFs，我们建议3天作为最小时间段的采样率，在消除检测诱导的伪影和连续探测细胞活力之间取得平衡。