基于BICP0-gB融合蛋白的间接ELISA法：提升牛α疱疹病毒1型感染诊断准确性的创新策略

本研究针对牛α疱疹病毒1型（BoHV-1）感染缺乏高精度诊断工具的难题，开发了一种基于BICP0和gB融合蛋白的间接ELISA（iELISA）方法。该方法展现出91.9%的灵敏度和97.6%的特异性，显著优于商业化试剂盒，为大规模筛查和精准防控BoHV-1提供了可靠技术支撑。

　　

牛α疱疹病毒1型（Bovine alphaherpesvirus 1, BoHV-1）是引发传染性牛鼻气管炎的主要病原体，对全球畜牧业造成严重经济损失，每年损失超过30亿美元。受感染的牛不仅会出现急性呼吸道症状，还会导致病毒终身潜伏和周期性排毒，并引起免疫抑制，增加继发细菌感染风险。目前，世界动物卫生组织（WOAH）推荐的病毒中和试验（Virus Neutralization Test, VNT）操作复杂、耗时长，难以适应大规模筛查；而现有的抗体检测ELISA试剂盒在准确度方面存在不足，且国内尚无商业化产品，依赖进口成本高昂。因此，开发一种高灵敏、高特异性的快速检测方法对BoHV-1的防控具有重要意义。

在该背景下，华中农业大学张森、宋丽媛等研究团队在《Veterinary and Animal Science》上发表论文，报道了一种新型间接ELISA方法（BICP0-gB iELISA），利用BoHV-1中早期关键蛋白BICP0与主要抗原蛋白gB构建融合抗原，显著提升了检测的准确性与可靠性。

本研究采用的关键技术方法包括：利用E. coli表达系统制备BICP0-gB融合蛋白；通过方阵滴定法优化iELISA反应条件（包被浓度、封闭剂、血清稀释度等）；以病毒中和试验为金标准，使用244份已知状态的血清样本评估该方法的诊断灵敏度与特异性；并采用临床样本（包括来自青海牦牛的200份血清）进行初步应用验证。

3.1. 重组质粒构建与BICP0-gB蛋白表达

成功构建pET-30a-BICP0-gB重组质粒，经双酶切和测序验证正确。表达并纯化出BICP0-gB融合蛋白，Western blot分析显示该蛋白可与BoHV-1阳性血清发生特异性反应，证明其具有良好的抗原性和反应原性。

3.2. BICP0-gB iELISA的建立与优化

通过系统优化，确定最佳包被浓度为4 μg/mL，血清稀释度为1:100，封闭剂为1%鱼明胶，封闭时间1小时，二抗稀释度1:5000，反应时间30分钟，显色时间15分钟。最终判定阈值为S/P ≥ 0.367（99.9%置信水平）。

3.3. 准确性评价

与VNT相比，BICP0-gB iELISA的灵敏度为91.9%，特异性为97.6%，总符合率为93.9%，Kappa值为0.87，显著优于商业化gB ELISA试剂盒（灵敏度85.1%，特异性96.4%）。

3.4. 分析特异性和灵敏度

该方法与牛呼吸道常见病原体（如M. bovis、BVDV、BPIV3等）阳性血清无交叉反应，最低检测限为1:400稀释，灵敏度高于商业化试剂盒（1:256）。

3.5. 重复性试验

批内和批间重复性试验显示，所有样本的变异系数（CV）均低于10%，表明该方法具有良好的重复性和稳定性。

3.6. 初步临床应用

在青海牦牛200份临床血清中，BICP0-gB iELISA检出阳性率为38.5%，真实流行率为40.3%。其阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）分别达到96.3%和94.7%，高于商业化试剂盒。

本研究成功建立了一种基于BICP0-gB融合蛋白的间接ELISA方法，具有高灵敏度、高特异性和强重复性，适用于BoHV-感染的大规模筛查和流行病学监测。该方法的建立不仅弥补了国内商业化ELISA试剂盒的空白，其优异的性能也使其在临床区分自然感染与疫苗免疫动物方面具备潜在应用价值。该研究为BoHV-1的防控提供了一种可靠、高效的诊断工具，对促进畜牧业健康发展具有重要意义。