优化体内碱基编辑技术恢复DFNA15小鼠模型听觉功能：基因治疗遗传性耳聋的新突破

本研究针对由POU4F3基因突变导致的常染色体显性非综合征性耳聋15型（DFNA15）缺乏有效治疗手段的难题，开发了新型腺嘌呤碱基编辑器SchABE8e，通过双AAV载体递送系统成功修复Pou4f3WT/Q113*小鼠模型的致病突变，实现长达4个月的听力功能近完全恢复。该研究为DFNA15的临床治疗提供了安全有效的基因编辑策略，发表于《Nature Communications》。

　　

全球约有4.3亿人受听力损失困扰，其中遗传因素占比超过60%。常染色体显性非综合征性耳聋15型（DFNA15）是由POU4F3基因突变引起的罕见遗传性耳聋，目前缺乏有效治疗手段。中国患者群体中主要存在POU4F3 c.337C>T突变，导致成年期发病、进行性加重的感音神经性听力损失。POU4F3作为内耳毛细胞特异性表达的转录因子，其功能缺失会导致毛细胞功能障碍和听力丧失。

为攻克这一难题，研究人员开发了新型腺嘌呤碱基编辑器SchABE8e，该工具将自主发现的SchCas9（识别简单NNGR PAM）与优化后的TadA-8e脱氨酶融合，具备高精度编辑特性。研究团队首先构建了模拟DFNA15的Pou4f3^WT/Q113*点突变小鼠模型，该模型表现出与患者相似的进行性听力损失和毛细胞退化特征。通过稳定细胞系筛选，发现SchABE8e与sgRNA3组合在体外实现48.5%的编辑效率，且旁观编辑仅6.2%。

为解决AAV载体包装容量限制，研究人员采用分裂内含肽介导的蛋白重组系统，将SchABE8e拆分为双AAV载体。使用 Anc80L65 衣壳通过圆窗膜注射方式递送至新生小鼠内耳，在cDNA水平实现30.4%的编辑效率。治疗后小鼠听力功能显著恢复，点击ABR阈值从70 dB SPL改善至60 dB SPL（与野生型相当），且效果持续至少4个月。免疫荧光分析显示POU4F3蛋白核定位恢复，毛细胞存活率显著提高。

安全性评估表明，该治疗策略不会影响野生型小鼠的正常听力功能、毛细胞形态和前庭功能，全基因组测序未检测到明显脱靶效应。然而该策略对纯合突变小鼠无效，表明治疗时间窗口存在限制。

本研究主要采用以下技术方法：通过CRISPR/Cas9构建Pou4f3^Q113*点突变小鼠模型；利用慢病毒转染建立稳定突变细胞系；采用分裂内含肽实现双AAV载体包装；通过圆窗膜注射进行体内递送；使用听觉脑干反应（ABR）和畸变产物耳声发射（DPOAE）评估听觉功能；采用全基因组测序（WGS）评估脱靶效应。

结果

建立Pou4f3点突变小鼠模型

研究人员成功构建了携带Pou4f3 c.337C>T（p.Q113*）突变的小鼠模型，该突变位于脊椎动物高度保守的POU4F3氨基酸区域。突变小鼠在出生后30天（P30）听力正常，但随后出现进行性听力损失。DPOAE检测显示早期外毛细胞（OHC）功能异常，免疫染色和扫描电镜证实了毛细胞丢失和静纤毛束形态异常。

优化靶向Pou4f3^Q113*突变位点的ABE

通过系统筛选9种ABE工具和5个sgRNA，发现SchABE8e-sgRNA3组合在保持中等编辑效率（48.5%）的同时，具有最低的旁观编辑（6.2%）和indel形成率（<1%）。该编辑器在人源化细胞模型中也显示出治疗潜力，对 human POU4F3^Q113*突变实现31.8%的编辑效率。

SchABE8e的特性和优化

SchABE8e具有广泛的编辑窗口（原型间隔位置6-14），主要产生A-to-G转换，indel频率始终低于1%。正交R环实验表明其Cas9非依赖性脱靶活性极低（≤1%）。虽然通过融合HMG或Rad51结构域可提高效率，但考虑到安全性，最终选择原始SchABE8e进行体内治疗。

AAV-SchABE8e-sgRNA3治疗策略

研究发现WPRE元件能显著增强内耳转基因表达。通过分裂内含肽系统将SchABE8e拆分为双AAV载体，变异体4显示最佳蛋白重组效率和编辑效果（41%），与全长SchABE8e相当。

SchABE8e的体内编辑效率和脱靶分析

双AAV系统递送后，基因组DNA和cDNA水平分别检测到3.8±0.9%和14.2±2.5%的编辑效率，最高分别达8.9%和30.4%。全基因组测序显示治疗组和对照组在SNV和indel数量上相当，未检测到脱靶编辑位点。

治疗恢复听觉功能

治疗后2个月，点击ABR阈值改善至60 dB SPL，与野生型相当。TB-ABR分析显示在4-16 kHz频率范围内听力显著改善，效果持续4个月。高频听力（24-32 kHz）虽有改善，但仍存在约25 dB SPL的残余缺损。

治疗恢复POU4F3核定位并增强毛细胞存活

免疫荧光分析显示治疗后POU4F3蛋白核定位显著恢复，毛细胞中核定位比例提高。治疗耳的中转和基转区域OHC数量显著高于未治疗耳，表明治疗改善了毛细胞保存。

双AAV-SchABE8e-sgRNA3治疗策略的内耳安全性

野生型小鼠注射后，ABR阈值无显著变化，毛细胞形态和数量无差异，前庭功能测试和体重监测均未发现异常，证明该治疗策略的安全性。

纯合小鼠治疗效果有限

该策略对Pou4f3^Q113/Q113纯合小鼠无效，因其在干预前已出现严重毛细胞损失，表明治疗时间窗口至关重要。

讨论与结论

本研究开发的SchABE8e碱基编辑器成功实现了DFNA15小鼠模型的听力功能恢复，通过双AAV递送系统在内耳实现高效精确的基因编辑。该工具具备NNGR PAM识别特性、广泛编辑窗口和高安全性，为治疗C·G-to-T·A突变相关的遗传性疾病提供了新方案。

与传统基因替代疗法相比，碱基编辑提供了永久性解决方案；与RNA编辑相比，其效果可遗传；与传统CRISPR/Cas9相比，编辑效率更高且indel形成率更低。虽然SchABE8e存在6.2%的旁观编辑，但通过优化递送系统和提高靶向性可进一步改善。

研究证实治疗能有效恢复POU4F3核定位和毛细胞功能，听力改善在中低频范围最为显著，高频听力恢复受限可能与基底转病毒转导效率较低有关。安全性评估表明局部治疗不会影响内耳正常结构和功能。

该研究为DFNA15的临床治疗奠定了坚实基础，SchABE8e平台也有望应用于其他遗传性耳聋的治疗。未来研究将聚焦于优化递送效率、提高靶向特异性和探索更早治疗时间窗口，推动遗传性耳聋基因治疗向临床转化。