复制体穿越黏连蛋白环的实时单分子成像揭示姐妹染色单体黏连建立新机制

为解决真核生物DNA复制后姐妹染色单体黏连建立的机制难题，研究人员开展复制体与黏连蛋白环相遇的单分子成像研究，发现复制体可穿越黏连蛋白环并直接建立姐妹染色单体黏连，DNA聚合酶Polα和Polε是决定性分子元件。该研究为染色体遗传稳定性机制提供直接证据，颠覆了对传统黏连建立因子作用的认知。

　　

在真核细胞生命活动中，基因组复制和染色体分离是两个核心生物学过程，而姐妹染色单体黏连(sister chromatid cohesion)则是连接这两个过程的关键环节。复制后的姐妹染色单体需要被黏连蛋白(cohesin)环状复合物紧密连接，才能在细胞分裂时被纺锤体正确分离。尽管早在二十多年前就发现黏连蛋白的环状结构可能允许复制机器(replisome)直接通过，从而同时捕获两条新生DNA分子，但这一假说始终缺乏直接证据。由于黏连蛋白在DNA上通常呈现"塌陷"的构象状态，其直径虽理论上可达35纳米，但实际可能无法允许直径约25纳米的复制体通过。此外，多个黏连建立因子（如Tof1-Csm3-Mrc1复合物、Chl1等）被认为通过蛋白质相互作用辅助黏连建立，但它们在分子机制中的具体作用仍不明确。

为解决这一基础生物学难题，英国弗朗西斯·克里克研究所的Samson Glaser、Maxim I. Molodtsov、John F.X. Diffley和Frank Uhlmann团队在《Cell》上发表了最新研究。他们利用生化重建和单分子荧光显微技术，首次实时观测了复制体与黏连蛋白环的相遇过程，发现复制体能够直接穿越黏连蛋白环，并且这一物理过程直接导致姐妹染色单体黏连的建立。研究还出人意料地揭示DNA聚合酶Polα和Polε在这一过程中的关键作用，而传统认知的黏连建立因子反而作用有限。

研究主要采用了以下几种关键技术方法：一是利用酿酒酵母系统纯化荧光标记的黏连蛋白复合物和CMG解旋酶(Cdc45-Mcm2-7-GINS)；二是通过微流控芯片和全内反射荧光显微镜(TIRF)进行单分子实时成像；三是设计双叉线性DNA模板模拟复制叉结构；四是通过抗体锚定技术限制黏连蛋白移动性；五是多色荧光标记追踪蛋白与DNA互作动态。实验还包含了完整的复制体重建、ATP酶活性分析、DNA张力测量等生化与生物物理手段。

研究结果部分通过多个精心设计的实验逐步推进：

在"CMG作为可克服的黏连蛋白屏障"部分，研究人员首先发现单独的CMG解旋酶在遇到黏连蛋白时，约有10%的概率能够穿越通过。当加入黏连建立因子Ctf4-Chl1和TCM后，穿越频率有所提高。更重要的是，当限制黏连蛋白的移动性（模拟染色质环境）时，穿越频率显著增加。

在"相向运动的CMG解旋酶穿越黏连蛋白"实验中，两个相向移动的CMG解旋酶能够推动中间的黏连蛋白穿越通过，且穿越后黏连蛋白保持拓扑捕获DNA状态，证明环状结构在穿越过程中保持完整。

在"CMG穿越固定化黏连蛋白"部分，通过V5抗体将黏连蛋白锚定在流动池表面，CMG的穿越频率提高到40%。研究人员还观察到CMG在穿越前会出现短暂停滞，伴随DNA张力增加，通过计算发现这些力远低于破坏黏连蛋白环所需的力，支持穿越而非环破裂的机制。

最关键的证据来自"CMG穿越黏连蛋白环"实验。研究人员通过侧向流动拉伸DNA形成V形结构，证明在CMG穿越过程中DNA始终保持在环内，穿越后肽段洗脱使黏连蛋白恢复扩散运动，直接证实拓扑捕获状态在穿越过程中得以保持。

在"姐妹染色单体黏连的建立"部分，完整复制体能够以更高效率(18%)穿越黏连蛋白，其中74%的穿越事件成功建立稳定的姐妹染色单体黏连，表现为两条新生DNA分子被共同捕获在黏连蛋白环内。当复制体在模板DNA后段遇到黏连蛋白时，黏连建立效率接近100%，表明更长的DNA链有助于稳定捕获。

在"复制体促进黏连蛋白穿越的分子决定因素"中，令人惊讶的是，传统黏连建立因子（Tof1-Csm3、Mrc1、Chl1）的缺失并不影响复制体的穿越能力和黏连建立效率。相反，DNA聚合酶Polα的缺失完全阻止穿越，而Polε的催化结构域缺失虽降低穿越频率，但其C端非催化结构域足以支持穿越功能。

最后，在"复制体和黏连蛋白在黏连建立过程中的动态"部分，研究人员使用预组装复制体（无游离聚合酶）证明完整复制体可直接穿越黏连蛋白环，无需聚合酶解离和重新结合。使用ATP水解缺陷的EQ黏连蛋白或省略Scc2-Scc4装载复合物并不影响穿越效率，表明这一过程不需要黏连蛋白的ATP酶活性。

研究结论和讨论部分强调，这项工作直接证实了复制体穿越黏连蛋白环的物理机制是姐妹染色单体黏连建立的重要途径。黏连蛋白环具有足够的柔韧性允许复制体通过，这一过程可能由DNA张力、蛋白质间相互作用以及复制体内部元件的协同作用共同促进。特别是DNA聚合酶Polα和Polε作为新型黏连建立因子的发现，挑战了传统认知，需要重新评估各类黏连建立因子的功能分工。

该研究的重要意义在于首次直接可视化观察姐妹染色单体黏连建立的关键时刻，为解决这一长期悬而未决的基础生物学问题提供了直接证据。研究结果支持一个简单而优雅的模型：复制体通过黏连蛋白环的物理过程直接实现姐妹染色单体的共捕获，这可能是真核生物中连接DNA复制和染色体分离的核心机制。同时，研究也为理解染色体不稳定性疾病和癌症发生提供了新的分子视角，为后续研究染色质环境下的黏连建立机制奠定了基础。