p53介导的表胚层细胞数量调控可预测小鼠胚胎滞育期的再激活潜能

本刊推荐：为解决胚胎滞育期细胞静止状态的异质性问题，研究人员开展p53-Bax通路调控表胚层(Epi)细胞稳态的研究，发现约5%细胞在滞育后期保持增殖活性，p53通过Bax介导的凋亡精确调控Epi细胞数量，胚胎再激活成功率与Epi细胞数(≥7个)呈正相关，为哺乳动物胚胎休眠机制提供新范式。

在哺乳动物生殖生物学中，胚胎滞育（embryonic diapause）是一种奇妙的生命暂停现象，至少130种哺乳动物通过这种策略延迟胚胎着床，以应对不利的环境条件或哺乳期资源竞争。这种现象最早在150年前于欧洲狍（Capreolus capreolus）中被记载，而在人类中，类似滞育的状态可能存在于某些灵长类动物应对母体应激反应时。小鼠作为研究胚胎滞育的经典模型，其研究价值不仅在于揭示生殖生物学机制，更因其与肿瘤休眠状态存在惊人的相似性——两者都涉及细胞周期暂停、代谢重组和后续再激活的调控过程。

传统观点认为，小鼠胚胎进入滞育后，所有细胞会在7天内同步进入G₀期静止状态，直到滞育第8.5天（D8.5）完全停止增殖。然而，这种统一化的认知与滞育胚胎中存在的细胞异质性现象存在矛盾，特别是关于不同胚层细胞（滋养外胚层、表胚层和原始内胚层）是否采用相同的细胞周期退出机制，以及何种分子通路调控滞育状态的维持与退出，这些关键问题尚未得到充分解答。更重要的是，胚胎成功再激活的决定性因素究竟是什么？这个关乎生命起源的核心谜题一直困扰着研究人员。

针对这些科学难题，Tokushima University的Katsuyoshi Takaoka教授团队在《Cell Reports》上发表了突破性研究成果。通过单细胞水平的多组学分析结合基因编辑技术，研究团队揭示了p53-Bax信号通路在调控表胚层（epiblast, Epi）细胞数量中的核心作用，并首次建立Epi细胞数量与再激活成功率的量化关系，挑战了长期以来关于胚胎滞育中细胞周期同步化的传统认知。

研究主要采用了以下关键技术：①激光捕获显微切割技术分离不同胚层组织进行RNA测序；②CRISPR/Cas9基因编辑构建Trp53^-/-和Bax^-/-突变小鼠模型；③EdU标记和Ki67/CyclinA2免疫荧光染色进行细胞周期精确分期；④显微操作技术进行Epi细胞数人工调控实验；⑤单细胞RNA测序数据重分析验证细胞周期状态。所有实验均使用ICR品系野生型小鼠和B6D2F1品系转基因小鼠，胚胎样本通过激素处理诱导滞育状态。

细胞周期动态变化与滞育异质性

通过Ki67和CyclinA2免疫荧光染色，研究人员对正常发育和滞育胚胎各阶段进行了系统分析。意外发现，即使在滞育后期（D10.5后），仍有约5%的细胞保持增殖活性，这些细胞主要处于G₁期，挑战了"所有细胞在D10.5进入G₀期"的传统认知。EdU连续标记实验进一步证实，增殖细胞并非来源于特定谱系，而是可逆地在增殖与G₀期之间转换，类似于休眠癌细胞的特性。

更重要的是，研究揭示了不同胚层细胞采用不同的细胞周期退出策略： mural trophectoderm（mTE）在正常发育E4.25-E4.5阶段就发生G₀期退出，而polar trophectoderm（pTE）、epiblast（Epi）和primitive endoderm（PrE）的G₀期退出才是胚胎滞育的特异性标志。这种异质性提示不同胚层可能采用不同的分子机制调控滞育状态。

不同胚层细胞的可逆性滞育特征

通过单细胞谱系追踪实验，研究人员注入H2B::mClover3和Cre mRNA到E3.5胚胎的单个pTE细胞，发现到D7.5时平均产生6.4个标记细胞，表明pTE细胞并未在滞育启动后立即进入G₀期。相反，mTE来源的细胞在滞育期间几乎不增殖（仅2.1个细胞），但在再激活后迅速扩增。

转录组分析显示，mTE细胞在滞育期间特异性下调Lbr（lamin B receptor）表达，仅13%的mTE细胞表达Lbr，而再激活胚胎中表达率恢复至65.8%。虽然mTE细胞表现出衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性，但缺乏典型衰老相关分泌表型（SASP）标志物如Il6的表达，表明其处于一种可逆的"类衰老"状态而非终末衰老。

p53介导的稳态维持机制

尽管总细胞数在D8.5后趋于稳定，但凋亡分析显示随着滞育进行，凋亡细胞数量逐渐增加。p21::GFP报告小鼠显示p21（p53下游靶点）以镶嵌模式在所有组织中表达。虽然增殖细胞（Ki67⁺）中γH2AX焦点数（DNA损伤标志）高于G₀期细胞，但与滞育前胚胎相当，表明这些损伤主要源于正常复制错误而非应激反应。

p53敲除胚胎分析揭示其Epi细胞数显著增加，但总细胞数不变。p53^-/-滞育胚胎中Ki67⁺细胞比例增加15%，且mTE和pTE组织中增殖细胞的γH2AX焦点数显著升高，表明p53通过细胞周期阻滞促进DNA损伤修复。然而，Epi和PrE组织中的DNA损伤反应似乎存在p53非依赖性途径。

p53-Bax通路调控Epi细胞数量

免疫染色显示Bax特异性在Epi细胞中表达，而p53敲除胚胎中Bax表达降低。Bax敲除胚胎表型与p53敲除类似：总细胞数不变但Epi细胞数显著增加。这表明p53通过调控Bax表达介导Epi细胞凋亡，从而精确控制Epi细胞数量。

Epi细胞数量决定再激活成功率

通过R26R-H2B::cherry KI和Nanog-GFP双标记系统，研究人员发现野生型滞育胚胎中Epi细胞数存在显著变异（2-27个）。再激活实验表明，含7-14个Epi细胞的胚胎再激活成功率达78.6%，15-27个细胞胚胎为72.7%，而少于7个细胞的胚胎仅18.9%成功再激活。

显微操作实验进一步证实这一因果关系：将Epi细胞数从7-17个减少至7-11个，再激活率达90.9%；而减少至2-5个时，再激活完全失败。值得注意的是，p53和Bax敲除胚胎（Epi细胞数过多）的再激活率也显著降低（14.9%和11.7%），表明偏离最佳Epi细胞数（6-17个）都会损害再激活潜力。形态学观察发现，少于6个Epi细胞的胚胎无法形成玫瑰花结样结构，这可能是再激活失败的结构基础。

研究结论表明，小鼠胚胎滞育并非统一的细胞周期暂停过程，而是存在显著的细胞异质性。p53-Bax通路通过调控凋亡精确控制Epi细胞数量，这种数量调控对胚胎成功再激活至关重要。Epi细胞数量可作为预测再激活潜力的生物标志物，为理解哺乳动物胚胎休眠提供了新视角。

讨论部分指出，该研究揭示了滞育胚胎中持续的细胞增殖活动，这与狍等物种的滞育特征更为相似，提示哺乳动物胚胎滞育机制可能具有进化保守性。研究建立的Epi细胞数量与再激活成功率的量化关系，为评估胚胎活力提供了实用指标。然而，关于p53激活的具体上游信号（DNA损伤或缺氧）以及Epi细胞数影响再激活的具体机制，仍需进一步探索。这些发现不仅深化了对胚胎发育可塑性的理解，也为研究肿瘤休眠等细胞暂停现象提供了重要借鉴。