揭示Vps74/yGOLPH3识别高尔基体膜蛋白客户分子的结合位点及其在癌症治疗中的潜在应用

本研究针对高尔基体膜蛋白分选适配器Vps74/yGOLPH3如何识别并结合其客户蛋白的科学问题，通过综合运用结构生物学、生物化学和细胞生物学技术，鉴定了Vps74上由两个进化保守环（Loop1和Loop2）、PI4P结合位点和β发夹结构组成的客户结合界面，并发现该位点与Sac1和Arf1-GTP的结合位点重叠。研究还筛选到一种抑制性纳米抗体Vps74InNb#4，可阻断客户结合并影响Golgi定位，为靶向GOLPH3的癌症治疗提供了新策略。

　　

在高尔基体这个细胞内的蛋白质分选中心，维持其功能和组成完整性依赖于区分驻留蛋白和非驻留蛋白的能力。高尔基体驻留蛋白通常是膜整合蛋白，参与蛋白质和脂质的糖基化、离子转运、蛋白水解加工以及脂质合成和加工等过程。与其它细胞内细胞器不同，高尔基体由多个称为囊腔（cisterna）的子区室组成，新合成的蛋白质从顺式（cis）、 medial 到反式（trans）定向运输，在此过程中它们被依次顺序修饰。修饰新生蛋白质的酶在其发挥功能的囊腔中富集，因此高尔基体不仅需要区分驻留蛋白和非驻留蛋白，还需要维持其天然蛋白质的正确囊腔分布。

目前主流的高尔基体蛋白质滞留模型是囊腔成熟模型，该模型规定囊腔身份是通过驻留蛋白从反式到顺式囊腔的捕获和回收循环来维持的，这一过程由COPI-外壳体（coatomer）包被的囊泡介导。理解高尔基体区室化蛋白质组成维持的关键在于阐明驻留蛋白如何被识别、选择并分选进入COPI囊泡。除了揭示基础细胞生物学原理外，高尔基体功能缺陷与人类疾病相关，包括先天性糖基化缺陷、神经退行性疾病以及多种癌症。

迄今为止，已经鉴定出几种高尔基体蛋白质分选适配器，包括GOLPH3（酵母细胞中的Vps74）、Erd1、FAM114A2以及最近的LYSET。就GOLPH3s而言，该适配器与某些高尔基体膜蛋白的较短、暴露在细胞质中的N末端结合。GOLPH3s客户蛋白的N末端在其长度和氨基酸序列上有所不同，但通常由一组疏水氨基酸或带正电的氨基酸（如赖氨酸和精氨酸）组成。与GOLPH3s类似，FAM114A2蛋白似乎也识别一组碱性氨基酸，而Erd1识别的高尔基体驻留蛋白特征目前尚不清楚。LYSET是一种非典型的GOLPH3客户蛋白，其在高尔基体的滞留对于某些蛋白质分选到溶酶体至关重要。GOLPH3s直接与外壳体结合，提供了客户蛋白结合和并入COPI囊泡之间的机制联系。

GOLPH3是一个癌基因。GOLPH3的扩增在几种癌症中观察到，并与不良预后相关，揭示了该高尔基体蛋白在癌症进展中的重要作用。最初有人认为GOLPH3的致癌特性与增强mTOR激活有关。然而，最近的研究表明，GOLPH3的致癌作用涉及其对某些高尔基体膜蛋白滞留的需求。

酵母和人类GOLPH3s的晶体结构已经确定，它们的折叠结构域具有惊人的相似性。从这些结构推测，GOLPH3s与PI4P（一种在反式高尔基体囊腔和反式高尔基体网络（TGN）中富集的磷酸肌醇）结合。在推定的PI4P结合位点进行氨基酸替换导致高尔基体膜结合丧失，并伴随Vps74客户蛋白从高尔基体错误定位到液泡。对Vps74/GOLPH3s折叠结构域特征的进一步研究揭示了保守β发夹在膜结合中的作用。因此，PI4P结合和蛋白质β发夹的疏水尖端可能解释了GOLPH3s的高尔基体膜定位。然而，尚不清楚这两个决定因素是否足够，或者PI4P和β发夹是否都是膜招募所必需的。

进一步的结构和生化研究表明，GOLPH3s与Sac1（一种PI4P磷酸酶）结合，并且GOLPH3s是Sac1效应蛋白。然而，PI4P结合在多大程度上参与适配体-客户结合仍有待确定。GOLPH3s的N末端区域长度因物种而异，并且可能是内在无序的，然而该区域包含一个进化上保守的精氨酸簇，这些精氨酸对于适配体与外壳体的结合至关重要。

生化研究表明，Vps74与外壳体相关的小GTP酶Arf1结合。Arf1和Vps74的关联由Vps74的折叠结构域介导，并且需要Arf1与GTP结合。这种相互作用的功能相关性尚未研究，但对Arf1-GTP的必要性表明与Vps74的相互作用发生在高尔基体膜上。

重要的是，目前尚不清楚客户蛋白结合在GOLPH3s上的位置。这些信息对于扩展我们对膜蛋白保留在高尔基体中的分子机制的理解至关重要，并将为GOLPH3s在癌细胞中的治疗干预策略提供信息。

本研究报道了酵母GOLPH3适配器Vps74上客户结合位点的鉴定。客户结合是通过两个进化上保守的膜相对环、PI4P结合位点和β发夹介导的，这表明客户-适配器结合的模式可能在GOLPH3s中是保守的。此外，我们确定客户过表达足以将Vps74招募到高尔基体。我们进一步表明，Vps74上的客户结合位点与Sac1和Arf1-GTP的结合位点重叠，这一发现对Sac1和Arf1-GTP在GOLPH3介导的高尔基体膜蛋白滞留中的作用具有重要意义。在正交方法中，我们利用抑制性抗Vps74纳米抗体在生化研究中证实了客户结合位点，并确定了Sac1和Arf1在Vps74上的结合位点。

为了开展这项研究，研究人员综合运用了多种关键技术方法。研究采用了酵母遗传学方法，包括基因敲除、温度敏感型突变体分析和生长表型筛选（如使用钙荧光白（Calcofluor White, CFW）和5-氟乳清酸（5-FOA）平板）。蛋白质相互作用研究主要通过体外结合实验（in vitro binding assays）和竞争实验进行，使用了GST pull-down、Ni-NTA pull-down和Strep-tactin pull-down等技术。细胞生物学技术包括荧光显微镜（共聚焦显微镜）进行蛋白定位和共定位分析，以及使用辅助诱导降解系统（auxin-inducible degron, AID）动态调控蛋白水平（如Pik1降解）。结构生物学分析借助AlphaFold2和AlphaFold3进行蛋白质-蛋白质相互作用界面的预测和建模。此外，研究还利用了纳米抗体（nanobody）技术，从合成酵母表面展示库中筛选并鉴定了一种能够抑制Vps74功能的纳米抗体Vps74InNb#4。

Vps74定位于多个高尔基体囊腔

研究人员生成了三种mNeon标记的Vps74融合蛋白（Vps74-mNeon、mNeon-Vps74和Vps74-mNeon-Vps74），并证明它们均能功能性互补vps74Δ ted1Δ酵母菌株的生长缺陷，尽管效率有所不同。通过将其与不同高尔基体标志物（mCherry-Sed5（顺式）、Sec21-mScarlet（顺式、medial、反式）或Sec7-mScarlet（反式）共表达并进行共定位分析，发现Vps74定位于顺式、medial和反式囊腔，其分布与客户蛋白的分布相关。Vps74-mNeon的高尔基体 puncta（斑点）数量较少，表明其功能稍弱。

客户过表达足以将Vps74招募到高尔基体膜

研究发现，将客户基因（GRX7, MNN5, KRE2）置于高拷贝数质粒中过表达，可以显著增加表达Vps74-mNeon的细胞中的Vps74 puncta数量，而过表达非客户蛋白OCH1则无此效果。这种招募不改变Vps74在高尔基体各囊腔的分布比例，表明客户蛋白可以直接通过其N末端招募Vps74至膜上，这是一种独立于PI4P的膜招募机制。GRX7被鉴定为vps74-1 ted1Δ菌株温度敏感性的剂量抑制因子。

客户过表达不足以招募PI4P结合缺陷和β发夹变体的Vps74

研究人员构建了Vps74的PI4P结合位点（W88A, R97A, K178A, R181A）和β发夹缺失（Δ197-208）突变体。功能分析表明，只有R97A突变体完全丧失功能，而W88A和K178A R181A突变体在25°C下仍有部分功能，β发夹缺失突变体则导致温度敏感性和CFW敏感性。体外结合实验表明，R97A和β发夹缺失突变体与Mnn4 N末端的结合能力显著下降。客户过表达（Kre2或Grx7）只能招募野生型和W88A Vps74至膜上，而不能有效招募R97A、K178A R181A或β发夹缺失突变体。这些结果表明，R97和β发夹在客户结合中扮演关键角色，而不仅仅是膜招募。

PI4P结合可能是Vps74招募至高尔基体膜的共同必要条件

为了研究PI4P在Vps74膜招募中的作用，研究人员构建了将FAPP1的PH结构域（结合PI4P）插入Vps74二聚体中的嵌合体（Vps74-mNeon-PH-Vps74）。结果显示，所有Vps74变体（包括WT、W88A、R97A、K178A R181A、Δ197-208）在融合了PH结构域后都能形成puncta，表明PH结构域可以依赖PI4P将这些变体招募至膜上。然而，这些变体在维持客户蛋白（Mnn5, Kre2, Mnn4, Mnn2）稳态水平方面并不比其对应的无PH结构域的二聚体更好，甚至WT和W88A变体在反式囊腔富集时效率更低。通过使用AID系统降解PI4P激酶Pik1，研究发现PI4P水平下降导致Vps74 puncta减少，但在客户过表达（KRE2）的情况下，puncta减少的速度更慢，直到PI4P水平极低时才急剧下降。这支持了客户和PI4P在Vps74膜结合中的协同作用。

Vps74上的客户结合位点包括两个相邻的进化保守环

生物信息学分析发现了Vps74/GOLPH3s上两个进化保守、表面暴露的环（Loop1: 78-90; Loop2: 165-177），它们毗邻PI4P结合位点和β发夹。AlphaFold2预测客户N末端与Vps74的频繁接触点包括Loop1的W88, D90和Loop2的E166, W168, Q176。功能实验表明，同时突变Loop1和Loop2（87AAAA90 + 166AAA168）导致Vps74完全失活，而单独突变Loop1（87AAAA90）影响较小，单独突变Loop2（166AAA168）则严重影响部分客户（如Dcr2, Mnn4, Mnn2）的滞留。不同客户对Loop1和Loop2突变的敏感性不同，解释了GOLPH3s如何适应不同长度和序列的客户N末端。体外结合实验证实了这些环上的突变对Mnn4结合的影响。

纳米抗体Vps74InNb#4证实了Vps74上的客户结合位点

研究人员从合成酵母表面展示库中筛选出一种抑制性纳米抗体Vps74InNb#4，它能与Vps74以及人GOLPH3和GOLPH3L结合。在酵母中表达Vps74InNb#4会以显性负性方式抑制生长，降低客户蛋白（Dcr2, Mnn5, Kre2）的稳态水平，阻断Vps74与高尔基体膜的结合以及客户蛋白在体外的结合。AlphaFold3预测和体外实验证实，Vps74InNb#4结合在Vps74的β发夹和Loop1上，这与客户结合位点部分重叠。

Arf1-GTP和Sac1结合位点与客户结合位点重叠并排斥客户与Vps74的结合

研究发现，Sac1与客户（Mnn4）竞争结合Vps74，并且Sac1的结合依赖于Loop2。Sac1也与Arf1-GTP竞争结合Vps74。相反，Vps74InNb#4（结合Loop1和β发夹）阻断Arf1-GTP结合，但不影响Sac1结合。客户N末端（Mnn4）也能竞争抑制Arf1-GTP结合。这些结果表明，客户、Sac1和Arf1-GTP的结合位点在Vps74上存在重叠和竞争关系。Sac1（主要位于内质网）与Vps74的相互作用可能在特定条件下（如葡萄糖限制）发生，而Arf1-GTP可能通过结合客户空的适配体来防止其被无效地包装进COPI囊泡。

本研究成功鉴定了酵母高尔基体膜蛋白分选适配器Vps74（yGOLPH3）上与其客户蛋白N末端结合的关键位点。该位点是一个由两个进化保守环（Loop1和Loop2）、PI4P结合位点（特别是R97）以及β发夹结构共同组成的膜近端表面。研究证实，客户蛋白可以直接通过结合该位点将Vps74招募至高尔基体膜上，这是一种独立于但又可能与PI4P协同作用的膜招募机制。值得注意的是，该客户结合界面与Vps74的其他两个重要结合伙伴——PI4P磷酸酶Sac1和小GTP酶Arf1-GTP的结合位点存在显著重叠，三者之间存在竞争性结合关系。这种竞争关系暗示Sac1和Arf1-GTP可能在一定条件下负调控Vps74的客户结合活性，从而精细调控高尔基体的蛋白质分选过程。

研究的另一重要成果是筛选并鉴定了一种能够高效抑制Vps74功能的纳米抗体Vps74InNb#4。该纳米抗体不仅与酵母Vps74结合，还能与人GOLPH3及其旁系同源物GOLPH3L结合，并能有效阻断客户蛋白结合、破坏Vps74的高尔基体定位、导致客户蛋白错误定位至液泡并降解。由于其作用靶点（GOLPH3）在多种癌症中扩增并作为癌基因发挥作用，Vps74InNb#4为开发靶向GOLPH3的新型癌症治疗策略提供了极具潜力的先导化合物或研究工具。

该研究深化了对GOLPH3家族蛋白分子机制的理解，揭示了其客户识别、膜招募以及与调控因子相互作用的精细调控网络。这些发现不仅对基础细胞生物学领域具有重要意义，特别是高尔基体生物学和细胞内蛋白质 trafficking 领域，也为针对GOLPH3过表达癌症的干预治疗提供了新的思路和潜在靶点。论文发表在《iScience》期刊上。