ST11型碳青霉烯类耐药高毒力肺炎克雷伯菌在严重感染期间blaKPC变体的快速替换导致对头孢他啶/阿维巴坦耐药

本研究针对高毒力头孢他啶/阿维巴坦(CAZ/AVI)耐药肺炎克雷伯菌(Kp)的体内进化机制展开系统研究，通过全基因组测序和体外进化实验，首次发现blaKPC基因扩增和突变（尤其是新型blaKPC-144变体）可同时或序贯出现，介导CAZ/AVI耐药，且携带blaKPC-144的菌株具有竞争优势，这对临床耐药监测和抗生素合理使用具有重要意义。

　　

在当今全球公共卫生领域，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae, CRKP）的蔓延已成为严峻挑战。这类“超级细菌”对绝大多数抗菌药物耐药，导致临床治疗选择极其有限，患者死亡率显著升高。更令人担忧的是，传统上主要引起社区获得性感染的高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent K. pneumoniae, hvKp）近年来也开始获得碳青霉烯类耐药性，进化成为碳青霉烯类耐药高毒力肺炎克雷伯菌（CR-hvKp），对临床感染防控构成了双重威胁。

面对这一困境，新型β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合药物，如头孢他啶/阿维巴坦（Ceftazidime/Avibactam, CAZ/AVI），为治疗CRKP感染带来了希望。然而，细菌的适应性极强，在CAZ/AVI的治疗压力下，能够通过快速突变产生耐药性，导致治疗失败。其中，编码KPC碳青霉酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemase）的bla_KPC基因发生突变，产生新的变体，是导致CAZ/AVI耐药的主要机制之一。这些变体通过改变碳青霉酶活性位点的氨基酸序列，使阿维巴坦无法有效抑制酶活性，从而让细菌存活。尽管已有研究报道了多种bla_KPC变体，但它们在宿主体内长期的系统微进化特征，特别是变异与基因扩增如何共同作用并影响菌株间的竞争，仍是未解之谜。

为了阐明这些问题，由北京大学第三医院沈宁教授和鲁明教授领衔的研究团队，在《Journal of Antimicrobial Chemotherapy》上发表了一项深入的研究。他们通过对一例患有严重复发性骨髓炎的患者进行长达两年的追踪，分离并系统分析了39株肺炎克雷伯菌临床分离株，结合体外进化实验，揭示了bla_KPC变体在CAZ/AVI压力下快速演变和替换的动态过程及其分子机制。

本研究的关键技术方法主要包括：从一位38岁男性复发性创伤性骨髓炎患者的伤口引流液中连续两年收集39株Kp临床分离株；使用VITEK-2系统和Etest法进行抗菌药物敏感性试验；采用Illumina和纳米孔测序平台进行全基因组测序（WGS），以分析序列类型（ST）、血清型、耐药基因、毒力基因、插入序列（IS）和质粒复制子类型；通过实时荧光定量PCR（qPCR和RT-qPCR）分析bla_KPC基因拷贝数、质粒拷贝数及相对表达水平；并通过生长曲线、体外竞争实验、质粒稳定性实验、转化实验和Galleria mellonella幼虫致死率实验评估菌株的生物学特性。

基因组特征揭示同一克隆来源的临床Kp分离株

所有39株分离株均属于ST11-K47型，并携带IncFIB和IncFII质粒。全基因组测序和系统进化分析显示，这些菌株源自同一祖先克隆，染色体仅存在14个单核苷酸多态性（SNP）差异。值得注意的是，所有菌株除一株（Kp25-2）外均被鉴定为高毒力表型（hvKp），携带iucABCD-iutA、rmpA2等毒力基因。耐药基因分析显示，所有菌株均携带多种耐药基因，其中37株为CRKP，25株对CAZ/AVI耐药。

多种bla_KPC亚型的出现和表达导致CAZ/AVI耐药性变化

研究发现，25株CAZ/AVI耐药菌的MIC值在16至>256 mg/L之间。全基因组测序揭示，24株（61.5%）携带一种新型bla_KPC变体bla_KPC-144（与bla_KPC-2相比存在A172T点突变），13株（33.3%）携带bla_KPC-2，2株（5.1%）不携带bla_KPC。qPCR分析进一步证实，CAZ/AVI的MIC值与bla_KPC基因的表达水平呈正相关。例如，携带bla_KPC-2的Kp19株因基因表达升高导致耐药（MIC=32 mg/L），而携带bla_KPC-144的Kp10-1、Kp6-2等菌株则表现出更高的表达水平和相应的更高MIC值。这表明bla_KPC基因表达的差异是临床菌株CAZ/AVI耐药表型变异的重要原因。

体内外进化过程中bla_KPC扩增和突变的快速转变

对患者体内分离株的分析发现，bla_KPC变体及其扩增现象普遍存在。例如，Kp4株携带两个拷贝的bla_KPC-2，而Kp10-1株的bla_KPC-144拷贝数增加了1.94倍。为了模拟这一过程，研究人员在体外对一株CAZ/AVI敏感（MIC=2 mg/L）且携带单拷贝bla_KPC-2的索引菌株（Kp1-1）施加不同浓度的CAZ/AVI压力。结果表明，在低浓度（1/0.25 mg/L）CAZ/AVI下，bla_KPC拷贝数增加，但质粒拷贝数和基因表达水平变化不大；在中浓度（2/0.5 mg/L）下，bla_KPC拷贝数持续增加，且其表达水平与MIC值升高相对应；而在高浓度（4/1 mg/L）下，bla_KPC拷贝数显著增加，同时随机出现了多种bla_KPC点突变，导致高水平耐药（MIC最高达48 mg/L）。值得注意的是，在撤除抗生素压力后，由基因扩增和高表达介导的耐药性会缓慢下降，表明这种适应性变化在一定程度上是可逆的。

bla_KPC-144的竞争优势促进其快速替换bla_KPC-2

流行病学数据显示，在2021年分离的5株菌均携带bla_KPC-2，而到2023年，分离的34株菌中则有24株（70.6%）携带bla_KPC-144，10株携带bla_KPC-2，显示出明显的变体替换趋势。为了探究其内在原因，研究人员进行了竞争实验。结果表明，携带bla_KPC-144的菌株（Kp6-2）相对于携带bla_KPC-2的菌株（Kp1-1）和不携带bla_KPC的菌株（Kp20）表现出显著的竞争优势。生长曲线实验显示，在丰富培养基（LB肉汤）中，不同变体菌株的生长速度无显著差异，表明bla_KPC-144并未带来明显的适应性代价。质粒稳定性实验证实，携带bla_KPC-144和bla_KPC-2的质粒在无抗生素压力下连续传代10天后仍能保持高度稳定（保留率>80%）。此外，转化实验成功将bla_KPC-144基因转入敏感受体菌，并导致其对CAZ/AVI的MIC值升高至8 mg/L，直接证明了bla_KPC-144本身即可介导耐药。Galleria mellonella幼虫感染模型证实，这些临床菌株均保持了高毒力表型。

本研究首次综合体内和体外证据，系统阐述了CR-hvKp在长期感染和抗生素压力下，通过bla_KPC基因的扩增和突变（尤其是bla_KPC-144）来介导对CAZ/AVI的高水平耐药。更重要的是，研究发现携带bla_KPC-144的菌株在进化中具有竞争优势，能够快速替换掉原有的bla_KPC-2菌株，且这一过程并未以牺牲细菌毒力或适应性为代价。这些发现揭示了临床CAZ/AVI治疗失败的一个重要进化机制：抗生素压力不仅直接筛选出耐药突变株，更可能筛选出兼具耐药性和竞争优势的“成功”克隆，从而加剧感染的顽固性和治疗难度。研究强调了对感染患者进行实时病原体基因型和表型监测的极端重要性，为临床及时调整抗生素策略、遏制耐药菌播散提供了关键的科学依据。