古菌DNA损伤响应通路中Orc1-2磷酸化修饰的调控机制及其功能研究

本研究聚焦古菌DNA损伤响应（DDR）通路中全局调控因子Orc1-2的翻译后修饰机制。通过磷酸化组学分析发现T356位点的磷酸化状态差异，结合磷酸模拟（T356D）和磷酸消除（T356A）突变体实验，证实T356磷酸化通过削弱Orc1-2与DNA结合能力负向调控DDR进程。该研究揭示了古菌DDR通路的新型调控方式，为原核生物应激响应机制提供了重要理论突破。

　　

在生命演化的漫长历程中，古菌作为第三域生命体，其独特的生物学特性一直吸引着科学家的目光。它们既具有与真核生物相似的信息处理机制（如DNA复制、转录和翻译），又保留了类似细菌的代谢特征，这种特殊的进化地位使古菌成为研究生命起源和进化的重要模型。特别是在极端环境中生存的古菌，必须具备高效的DNA损伤应对机制，以维持基因组的稳定性。然而，与细菌和真核生物相比，古菌DNA损伤响应（DDR）通路的调控机制仍有许多未解之谜。

近年来，对冰岛硫化叶菌（Saccharolobus islandicus，原名Sulfolobus islandicus）的研究揭示了一个令人惊讶的现象：该古菌通过Orc1-2蛋白（Orc1/Cdc6家族蛋白的同源物）介导DDR调控，协调一系列细胞对DNA损伤的响应。Orc1-2作为古菌特异的全局转录调控因子，能够激活DNA修复相关基因的表达，同时抑制DNA复制和细胞周期进程相关基因。但令人困惑的是，Orc1-2蛋白的上调虽然是DDR激活所必需的，却不足以完全激活该通路，这暗示着可能存在翻译后修饰（PTMs）的精细调控。

为了解开这个谜团，山东大学CRISPR与古菌生物学研究中心的研究团队开展了一项深入研究。他们通过对正常生长和DNA损伤处理条件下的Orc1-2蛋白进行差异PTMs分析，发现了一个关键调控机制：仅在未处理细胞中，Orc1-2蛋白的T356位点发生磷酸化修饰。这一发现发表在《Nucleic Acids Research》上，为理解古菌DDR通路的调控机制提供了重要见解。

研究人员采用了多种关键技术方法开展本研究：首先通过CRISPR基因编辑技术构建了原位标记的orc1-2His菌株，用于蛋白纯化；利用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）分析鉴定Orc1-2的磷酸化位点；通过体外表达纯化获得野生型和突变型Orc1-2蛋白；采用电泳迁移率变动分析（EMSA）检测蛋白与DNA的结合能力；使用染色质分级分析研究蛋白在体内的染色质结合状态；通过RNA测序（RNA-seq）技术分析全局基因表达变化；并利用细胞存活率测定、流式细胞术和显微镜观察等多项技术评估突变菌株的表型特征。

Saccharolobus islandicus Orc1-2在正常生长过程中经历苏氨酸356位点的磷酸化

研究人员首先构建了C端带有6×His标签的Orc1-2蛋白原位标记菌株（orc1-2His），通过生长曲线和蛋白质印迹分析证实该标签不影响Orc1-2的正常功能和DDR调控能力。从正常生长和NQO处理（6小时后）的细胞中纯化His标签Orc1-2蛋白，通过HPLC-MS/MS分析发现了一系列差异PTMs，包括16个甲基化位点和1个磷酸化位点。磷酸化发生在H355-R363肽段上，进一步分析确定T356为磷酸化位点。重要的是，这种磷酸化仅出现在正常生长细胞的Orc1-2蛋白中，而在DNA损伤应激细胞中该位点保持非磷酸化状态。

磷酸模拟突变T356D削弱Orc1-2调控因子的启动子DNA结合活性

序列比对和结构预测分析显示，T356位于Orc1-2蛋白WH（Winged Helix）结构域的螺旋区域，紧邻保守的精氨酸对（R353R354），而该区域与另一个精氨酸对（R381R383）共同构成DNA结合口袋。AlphaFold 3结构建模表明，这两个精氨酸对直接参与DNA结合，T356与DNA结合界面紧密相邻。磷酸化会在DNA结合口袋引入负电荷，从而干扰Orc1-2与DNA的相互作用。

为了验证这一假设，研究人员构建了磷酸消除突变体（Orc1-2T356A）和磷酸模拟突变体（Orc1-2T356D），并在大肠杆菌中表达纯化了这些蛋白。EMSA实验结果显示，Orc1-2T356A与野生型蛋白类似，能够有效结合含有5'-ANTTTC-3'保守 motif的启动子DNA片段，而Orc1-2T356D几乎完全丧失了DNA结合能力。体内染色质分级分析进一步证实，Orc1-2T356A在NQO处理后与染色质的结合能力增强，而Orc1-2T356D的染色质结合特征与未处理野生型相似。

磷酸消除突变Orc1-2T356A增强DNA损伤耐受性和细胞存活率

表型分析发现，orc1-2T356A菌株对NQO表现出比野生型更强的抗性，而orc1-2T356D菌株则与Δorc1-2缺失菌株类似，对DNA损伤剂高度敏感。细胞存活率测定显示，NQO处理12小时后，orc1-2T356A的存活率（22.44%）显著高于野生型（16.13%），而orc1-2T356D（3.95%）和Δorc1-2（2.98%）的存活率极低。24小时后，这种差异更加明显：orc1-2T356A存活率达42.35%，远高于野生型的24.20%。这些结果表明，非磷酸化的Orc1-2是激活DDR调控的功能形式，该形式的持续存在有助于细胞从DNA损伤中恢复并恢复正常生长。

磷酸模拟突变Orc1-2T356D基本消除了调控因子在DNA损伤响应中的功能

RNA-seq分析显示，orc1-2T356A的差异表达基因（DEGs）模式与野生型高度相似，而orc1-2T356D的表达模式与Δorc1-2几乎一致。野生型和orc1-2T356A中共同上调的基因包括那些已知功能的DDR相关基因，如编码易错DNA合成酶（促进DNA损伤耐受）的古菌Dpo2酶、参与细胞间DNA转移（导入DNA模板用于同源重组修复）的ups和ced系统基因，以及同源重组相关蛋白（NurA、Rad50、Mre11和HerA）编码基因。相比之下，Δorc1-2和orc1-2T356D的共同DEGs主要为12个功能未知的上调基因和40个下调基因。这些结果说明，T356磷酸化通过失活古菌全局DDR调控因子来负向调控DNA损伤修复相关基因的表达。

orc1-2T356A不再对DDR调控表现出严格控制

进一步表征发现，在亚致死剂量NQO（1μM）下，orc1-2T356A的生长延迟比野生型更轻微，且随着药物浓度增加，这种差异更加明显。细胞存活 assays显示，NQO处理6小时后，orc1-2T356A就表现出更高的存活率，且处理后的培养物达到了比未处理组更高的细胞密度。显微镜观察发现，NQO处理12、18和36小时后，orc1-2T356A形成的细胞聚集体比野生型更大，而细胞聚集是细胞内DNA转移（一种DNA损伤诱导的修复途径）的前提。Western blot分析证实，代表性DDR蛋白（Orc1-2和TFB3）在orc1-2T356A突变体中诱导更强烈且持续时间更长。

研究结论与讨论部分指出，该研究揭示了古菌采用蛋白质磷酸化机制来关闭Orc1-2介导的DDR调控。古菌DNA损伤响应的新兴调控原理特点是Orc1-2（古菌全局DDR调控因子）的逐步激活和双重失活机制。新合成的Orc1-2结合ATP且无T356磷酸化，在无DNA损伤时，Orc1-2通过磷酸化或ATP水解失活，这两种方式都能消除Orc1-2的DNA结合活性。DNA损伤后，Orc1-2合成强烈诱导，新合成的Orc1-2保持非磷酸化状态，从而结合DDR基因启动子激活其表达。DNA损伤修复完成后，通过ATP向ADP的转化和T356磷酸化两种独立机制失活Orc1-2的DDR调控。

有趣的是，每种失活机制的失活导致不同结果：ATP向ADP转化的失活是致死性的，而磷酸消除突变（orc1-2T356A）导致对NQO的抗性增加，在正常生长条件下与野生型生长速率无差异。从进化角度，古菌专长于在营养贫乏的极端环境中生存，精确控制能量使用是有优势的。及时激活和失活DDR过程可以节省能量，orc1-2T356A中合成更多Orc1-2和TFB3蛋白的事实也支持这一观点。因此，T356磷酸化控制对古菌细胞具有重要的进化优势。

该研究还讨论了古菌中可能负责Orc1-2 T356磷酸化的激酶。尽管古菌不编码任何真核DDR激酶同源物，但基因组分析发现冰岛硫化叶菌REY15A中有11个推定的真核样Ser/Thr蛋白激酶（ePKs），其中SiRe_2030和SiRe_2056被认为是主要激酶，在体外显示最强劲的活性。值得注意的是，S. solfataricus中SiRe_2030的同源物（Sso3207）在UV处理后表达下调，且本研究发现这两个激酶在Δorc1-2细胞中表达均受抑制，使它们成为修饰Orc1-2的候选激酶。

总之，这项研究不仅揭示了古菌DDR通路的新型调控机制，还为理解原核生物中转录调控因子的磷酸化调控提供了重要范例。古菌Orc1-2磷酸化调控的发现表明，原核生物中转录调控因子的磷酸化调控可能比目前认识的更为普遍。该研究为探索古菌环境适应性和进化机制提供了新视角，对理解生命的基本调控原理具有重要科学意义。